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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助！实时定量PCR所有CT值都是undetermined，熔解曲线可以做出来
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monazhou001

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助！实时定量PCR所有CT值都是undetermined，熔解曲线可以做出来

是不是cDNA浓度太高了呢？之前普通PCR其实用的浓度更高，大概一千多ng,20体系加了2微升可以出目标条带
做qPCR这回稀释了六倍，200ng每微升，20体系加了1微升
做出来所有CT都是无法识别的，溶解曲线应该没有什么问题看起来。。
可是也做了一下梯度五倍五倍的梯度，做了五个，没有一个出CT值的
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1楼 2013-03-21 17:25:19
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monazhou001

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-03-22 12:13:28
我们没有测cDNA浓度呢。。。一般就按照20ul体系：6ul水、10ulmix、上下游引物各1ul、模板2ul。可是我同时检测6个基因，相同的模板，就是其中一个检测不出来，其他的都很好。我觉得应该不是ｃＤＮＡ浓度太高的问题。 ...

可能我的cDNA质量有问题吧，我做了好几个基因一个都没出。。难道是太稀了。。当时用2μg总RNA20体系反转录，最后反转录液稀释了六倍，加了1微升到最后20体系里。。
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14楼2013-03-22 13:28:58
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monazhou001

新虫 (初入文坛)
又拿这次荧光定量的跑了一次电泳，没问题，可以出来目的条带
为什么CT出不来呢？？
求助大家。。
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2楼2013-03-21 19:54:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
没有CT值一般是产物荧光浓度在开始已经达到阈值或者跑完PCR后荧光未达到阈值。具体你是什么问题请自己分析一下。
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3楼2013-03-22 01:58:54
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monazhou001

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-22 01:58:54
没有CT值一般是产物荧光浓度在开始已经达到阈值或者跑完PCR后荧光未达到阈值。具体你是什么问题请自己分析一下。

谢谢，那做SYBR这种一般模板起始浓度应该是多少呢？
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4楼2013-03-22 08:37:56
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