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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助！实时定量PCR所有CT值都是undetermined，熔解曲线可以做出来
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monazhou001

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助！实时定量PCR所有CT值都是undetermined，熔解曲线可以做出来

是不是cDNA浓度太高了呢？之前普通PCR其实用的浓度更高，大概一千多ng,20体系加了2微升可以出目标条带
做qPCR这回稀释了六倍，200ng每微升，20体系加了1微升
做出来所有CT都是无法识别的，溶解曲线应该没有什么问题看起来。。
可是也做了一下梯度五倍五倍的梯度，做了五个，没有一个出CT值的
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1楼 2013-03-21 17:25:19
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monazhou001

新虫 (初入文坛)
又拿这次荧光定量的跑了一次电泳，没问题，可以出来目的条带
为什么CT出不来呢？？
求助大家。。
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2楼2013-03-21 19:54:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
没有CT值一般是产物荧光浓度在开始已经达到阈值或者跑完PCR后荧光未达到阈值。具体你是什么问题请自己分析一下。
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3楼2013-03-22 01:58:54
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monazhou001

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-22 01:58:54
没有CT值一般是产物荧光浓度在开始已经达到阈值或者跑完PCR后荧光未达到阈值。具体你是什么问题请自己分析一下。

谢谢，那做SYBR这种一般模板起始浓度应该是多少呢？
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4楼2013-03-22 08:37:56
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)
楼主。。。我最近也遇见同样的问题，你的问题解决了么？我普通PCR也能Ｐ出来的。。从来没遇见过这样的问题。。。有人说是仪器的那几个孔出现问题了。。我正在郁闷中。有人说叫我重新设计引物。。你的解决了么？
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keepon
5楼2013-03-22 08:44:16
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monazhou001

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-03-22 08:44:16
楼主。。。我最近也遇见同样的问题，你的问题解决了么？我普通PCR也能Ｐ出来的。。从来没遇见过这样的问题。。。有人说是仪器的那几个孔出现问题了。。我正在郁闷中。有人说叫我重新设计引物。。你的解决了么？

没有。。昨天刚刚做第一次，出现了这种问题
普通PCR能P出来不应该是引物的问题吧？
我本身以为是buffer出了问题，可是用跑完荧光的体系跑电泳也可以跑出来，SYBR又很灵敏，所以我感觉会不会是模板浓度太高造成的。。。
可是我的CT值那张图没出现任何峰
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6楼2013-03-22 08:51:42
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
monazhou001: 金币+12, ★★★很有帮助, 非常感谢 2013-03-22 18:12:47
引用回帖:
6楼: Originally posted by monazhou001 at 2013-03-22 08:51:42
没有。。昨天刚刚做第一次，出现了这种问题
普通PCR能P出来不应该是引物的问题吧？
我本身以为是buffer出了问题，可是用跑完荧光的体系跑电泳也可以跑出来，SYBR又很灵敏，所以我感觉会不会是模板浓度太高造成的 ...

我做了两次。。。两次都是同一个基因没有检测出来。。ＣＴ值那张图也没有任何峰。模板第一次用的是２ｕｌ。第二次我就只加了１ｕｌ，可是还是不能检测出来，我在怀疑是不是这个基因本身的表达就很低，所以检测不出来，我反倒认为是模板量太少了。。你认为呢？
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keepon
7楼2013-03-22 09:00:43
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monazhou001

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-03-22 09:00:43
我做了两次。。。两次都是同一个基因没有检测出来。。ＣＴ值那张图也没有任何峰。模板第一次用的是２ｕｌ。第二次我就只加了１ｕｌ，可是还是不能检测出来，我在怀疑是不是这个基因本身的表达就很低，所以检测不出 ...

你其他基因都可以出来么？那我感觉你这个可能是引物的问题吧？
你其他体系里都是cDNA当模板么，多少的量呢？
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8楼2013-03-22 09:17:45
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by monazhou001 at 2013-03-22 09:17:45
你其他基因都可以出来么？那我感觉你这个可能是引物的问题吧？
你其他体系里都是cDNA当模板么，多少的量呢？...

对的。。都是相同的体系，就是引物不一样而已。。但是普通ＰＣＲ是可以Ｐ出来的。我严重怀疑该基因本身表达量就很低。。
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keepon
9楼2013-03-22 10:31:06
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monazhou001

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-03-22 10:31:06
对的。。都是相同的体系，就是引物不一样而已。。但是普通ＰＣＲ是可以Ｐ出来的。我严重怀疑该基因本身表达量就很低。。...

你当时有测cDNA浓度么？20体系加了多少呢？
我的师兄曾经用相同的引物可以测出来，但是他现在不在实验室了，他说是可能cDNA浓度太高造成的，不过他不记得他当时的体系了
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10楼2013-03-22 11:34:07
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