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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助！实时定量PCR所有CT值都是undetermined，熔解曲线可以做出来
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by monazhou001 at 2013-03-22 11:34:07
你当时有测cDNA浓度么？20体系加了多少呢？
我的师兄曾经用相同的引物可以测出来，但是他现在不在实验室了，他说是可能cDNA浓度太高造成的，不过他不记得他当时的体系了...

我们没有测cDNA浓度呢。。。一般就按照20ul体系：6ul水、10ulmix、上下游引物各1ul、模板2ul。可是我同时检测6个基因，相同的模板，就是其中一个检测不出来，其他的都很好。我觉得应该不是ｃＤＮＡ浓度太高的问题。。我不知道这个问题应该怎么解决。。哎。。。
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keepon
11楼2013-03-22 12:13:28
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
monazhou001: 金币+8, ★★★很有帮助, 非常感谢！！ 2013-03-22 18:13:45
引用回帖:
4楼: Originally posted by monazhou001 at 2013-03-22 08:37:56
谢谢，那做SYBR这种一般模板起始浓度应该是多少呢？...

我没有测过cDNA的浓度，因为要消化掉RNA和除去dNTP才能测。一般我是用1μg总RNA做20μl体系反转录。反转录后的cDNA稀释5-10倍，用1μl做模板。
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12楼2013-03-22 12:28:03
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monazhou001

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-22 12:28:03
我没有测过cDNA的浓度，因为要消化掉RNA和除去dNTP才能测。一般我是用1μg总RNA做20μl体系反转录。反转录后的cDNA稀释5-10倍，用1μl做模板。...

我当时是用的是promega的反转录试剂盒，用2μg总RNA做的20体系反转录，最后CDNA是稀释了六倍，加了1μl
我看promega里面写的是反转录要用5μgRNA，那会不会是当时RNA太少了呢？
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13楼2013-03-22 13:22:57
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monazhou001

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-03-22 12:13:28
我们没有测cDNA浓度呢。。。一般就按照20ul体系：6ul水、10ulmix、上下游引物各1ul、模板2ul。可是我同时检测6个基因，相同的模板，就是其中一个检测不出来，其他的都很好。我觉得应该不是ｃＤＮＡ浓度太高的问题。 ...

可能我的cDNA质量有问题吧，我做了好几个基因一个都没出。。难道是太稀了。。当时用2μg总RNA20体系反转录，最后反转录液稀释了六倍，加了1微升到最后20体系里。。
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14楼2013-03-22 13:28:58
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monazhou001

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-03-22 12:13:28
我们没有测cDNA浓度呢。。。一般就按照20ul体系：6ul水、10ulmix、上下游引物各1ul、模板2ul。可是我同时检测6个基因，相同的模板，就是其中一个检测不出来，其他的都很好。我觉得应该不是ｃＤＮＡ浓度太高的问题。 ...

我又重新试了一下，可能是当时的试剂的问题，荧光降解了，这次什么都出来了。。谢谢了，以后再有别的问题再探讨，非常感谢
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15楼2013-03-22 18:08:40
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monazhou001

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-22 12:28:03
我没有测过cDNA的浓度，因为要消化掉RNA和除去dNTP才能测。一般我是用1μg总RNA做20μl体系反转录。反转录后的cDNA稀释5-10倍，用1μl做模板。...

非常感谢，是因为试剂出了问题
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16楼2013-03-22 18:09:27
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
13楼: Originally posted by monazhou001 at 2013-03-22 13:22:57
我当时是用的是promega的反转录试剂盒，用2μg总RNA做的20体系反转录，最后CDNA是稀释了六倍，加了1μl
我看promega里面写的是反转录要用5μgRNA，那会不会是当时RNA太少了呢？...

2μg RNA不算是少，一般用1μg也是可以的。我觉得有可能是做real-time的试剂问题。你同时做内参基因了吗？
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17楼2013-03-23 00:33:39
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by monazhou001 at 2013-03-22 18:08:40
我又重新试了一下，可能是当时的试剂的问题，荧光降解了，这次什么都出来了。。谢谢了，以后再有别的问题再探讨，非常感谢...

呜呜。。。可是我的试剂应该没有问题的啊。。。谢谢~~~
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keepon
18楼2013-03-23 09:51:24
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feixiang1209

新虫 (初入文坛)
试试其他的反应，要是溶解曲线看起来正常说明机器能检测到荧光啊。再降低下模板吧，电泳都能看到条带，QPCR肯定能检测到啊。
不知道你用的是什么牌子的机器，可以调的话把阈值调高点试试。
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19楼2013-05-07 21:17:37
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