应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助！实时定量PCR所有CT值都是undetermined，熔解曲线可以做出来
192/2返回列表上一页12
查看: 6773  |  回复: 18
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

zhlf1989513

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by monazhou001 at 2013-03-22 11:34:07
你当时有测cDNA浓度么？20体系加了多少呢？
我的师兄曾经用相同的引物可以测出来，但是他现在不在实验室了，他说是可能cDNA浓度太高造成的，不过他不记得他当时的体系了...

我们没有测cDNA浓度呢。。。一般就按照20ul体系：6ul水、10ulmix、上下游引物各1ul、模板2ul。可是我同时检测6个基因，相同的模板，就是其中一个检测不出来，其他的都很好。我觉得应该不是ｃＤＮＡ浓度太高的问题。。我不知道这个问题应该怎么解决。。哎。。。
赞一下 回复此楼
keepon
11楼2013-03-22 12:13:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
monazhou001: 金币+8, ★★★很有帮助, 非常感谢！！ 2013-03-22 18:13:45
引用回帖:
4楼: Originally posted by monazhou001 at 2013-03-22 08:37:56
谢谢，那做SYBR这种一般模板起始浓度应该是多少呢？...

我没有测过cDNA的浓度，因为要消化掉RNA和除去dNTP才能测。一般我是用1μg总RNA做20μl体系反转录。反转录后的cDNA稀释5-10倍，用1μl做模板。
赞一下 回复此楼
12楼2013-03-22 12:28:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

monazhou001

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-22 12:28:03
我没有测过cDNA的浓度，因为要消化掉RNA和除去dNTP才能测。一般我是用1μg总RNA做20μl体系反转录。反转录后的cDNA稀释5-10倍，用1μl做模板。...

我当时是用的是promega的反转录试剂盒，用2μg总RNA做的20体系反转录，最后CDNA是稀释了六倍，加了1μl
我看promega里面写的是反转录要用5μgRNA，那会不会是当时RNA太少了呢？
赞一下 回复此楼
13楼2013-03-22 13:22:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

monazhou001

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-03-22 12:13:28
我们没有测cDNA浓度呢。。。一般就按照20ul体系：6ul水、10ulmix、上下游引物各1ul、模板2ul。可是我同时检测6个基因，相同的模板，就是其中一个检测不出来，其他的都很好。我觉得应该不是ｃＤＮＡ浓度太高的问题。 ...

可能我的cDNA质量有问题吧，我做了好几个基因一个都没出。。难道是太稀了。。当时用2μg总RNA20体系反转录，最后反转录液稀释了六倍，加了1微升到最后20体系里。。
赞一下 回复此楼
14楼2013-03-22 13:28:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

monazhou001

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-03-22 12:13:28
我们没有测cDNA浓度呢。。。一般就按照20ul体系：6ul水、10ulmix、上下游引物各1ul、模板2ul。可是我同时检测6个基因，相同的模板，就是其中一个检测不出来，其他的都很好。我觉得应该不是ｃＤＮＡ浓度太高的问题。 ...

我又重新试了一下，可能是当时的试剂的问题，荧光降解了，这次什么都出来了。。谢谢了，以后再有别的问题再探讨，非常感谢
赞一下 回复此楼
15楼2013-03-22 18:08:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

monazhou001

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-22 12:28:03
我没有测过cDNA的浓度，因为要消化掉RNA和除去dNTP才能测。一般我是用1μg总RNA做20μl体系反转录。反转录后的cDNA稀释5-10倍，用1μl做模板。...

非常感谢，是因为试剂出了问题
赞一下 回复此楼
16楼2013-03-22 18:09:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
13楼: Originally posted by monazhou001 at 2013-03-22 13:22:57
我当时是用的是promega的反转录试剂盒，用2μg总RNA做的20体系反转录，最后CDNA是稀释了六倍，加了1μl
我看promega里面写的是反转录要用5μgRNA，那会不会是当时RNA太少了呢？...

2μg RNA不算是少，一般用1μg也是可以的。我觉得有可能是做real-time的试剂问题。你同时做内参基因了吗？
赞一下 回复此楼
17楼2013-03-23 00:33:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhlf1989513

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by monazhou001 at 2013-03-22 18:08:40
我又重新试了一下，可能是当时的试剂的问题，荧光降解了，这次什么都出来了。。谢谢了，以后再有别的问题再探讨，非常感谢...

呜呜。。。可是我的试剂应该没有问题的啊。。。谢谢~~~
赞一下 回复此楼
keepon
18楼2013-03-23 09:51:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

feixiang1209

新虫 (初入文坛)
试试其他的反应，要是溶解曲线看起来正常说明机器能检测到荧光啊。再降低下模板吧，电泳都能看到条带，QPCR肯定能检测到啊。
不知道你用的是什么牌子的机器，可以调的话把阈值调高点试试。
赞一下 回复此楼
19楼2013-05-07 21:17:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 monazhou001 的主题更新
192/2返回列表上一页12
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 估计是周四 +3 archvillain 2026-08-18 3/150 2026-08-21 01:48 by jnhyjjm
[基金申请] 基金啊基金 +3 longfie172 2026-08-20 3/150 2026-08-21 00:04 by wuchongjun
[基金申请] 科研孤儿太难了 +14 我4大白菜 2026-08-20 15/750 2026-08-20 22:33 by 袁向阳007
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +8 大萍1987 2026-08-20 10/500 2026-08-20 21:48 by 大萍1987
[基金申请] 言之凿凿，明天官网会通知放榜？ +15 医学老男孩 2026-08-20 17/850 2026-08-20 20:35 by CaoLG
[基金申请] 放榜前的不淡定 40+3 snowwithsea 2026-08-19 12/600 2026-08-20 15:56 by lfy8008
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +14 kkkl_v 2026-08-19 15/750 2026-08-20 08:21 by sunzitan
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +11 ziyangfang 2026-08-19 13/650 2026-08-19 21:28 by aasahr
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +4 yuleib84 2026-08-19 5/250 2026-08-19 19:52 by hhs666
[基金申请] 今天放榜吗？ +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +10 wangze12014 2026-08-14 12/600 2026-08-19 16:56 by 苦难博士
[基金申请] 2027广东省杰青 +4 奶牛小黑 2026-08-15 10/500 2026-08-19 11:02 by wanfengnew
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
[基金申请] 快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。 +6 Tide man 2026-08-14 7/350 2026-08-19 09:56 by ZJTJZ
[基金申请] 什么时候开奖？ +6 CrisMessi 2026-08-18 6/300 2026-08-19 08:06 by Equinoxhua
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[论文投稿] 投稿咨询 +4 wwm09 2026-08-17 6/300 2026-08-18 15:36 by wwm09
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +14 archvillain 2026-08-15 26/1300 2026-08-18 13:37 by phantomgost
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭