应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助！实时定量PCR所有CT值都是undetermined，熔解曲线可以做出来
汕头大学海洋科学接受调剂
191/2返回列表12下一页
查看: 6362  |  回复: 18
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

monazhou001

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助！实时定量PCR所有CT值都是undetermined，熔解曲线可以做出来

是不是cDNA浓度太高了呢？之前普通PCR其实用的浓度更高，大概一千多ng,20体系加了2微升可以出目标条带
做qPCR这回稀释了六倍，200ng每微升，20体系加了1微升
做出来所有CT都是无法识别的，溶解曲线应该没有什么问题看起来。。
可是也做了一下梯度五倍五倍的梯度，做了五个，没有一个出CT值的
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-03-21 17:25:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

monazhou001

新虫 (初入文坛)
又拿这次荧光定量的跑了一次电泳，没问题，可以出来目的条带
为什么CT出不来呢？？
求助大家。。
赞一下 回复此楼
2楼2013-03-21 19:54:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
没有CT值一般是产物荧光浓度在开始已经达到阈值或者跑完PCR后荧光未达到阈值。具体你是什么问题请自己分析一下。
赞一下 回复此楼
3楼2013-03-22 01:58:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

monazhou001

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-22 01:58:54
没有CT值一般是产物荧光浓度在开始已经达到阈值或者跑完PCR后荧光未达到阈值。具体你是什么问题请自己分析一下。

谢谢，那做SYBR这种一般模板起始浓度应该是多少呢？
赞一下 回复此楼
4楼2013-03-22 08:37:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhlf1989513

金虫 (小有名气)
楼主。。。我最近也遇见同样的问题，你的问题解决了么？我普通PCR也能Ｐ出来的。。从来没遇见过这样的问题。。。有人说是仪器的那几个孔出现问题了。。我正在郁闷中。有人说叫我重新设计引物。。你的解决了么？
赞一下 回复此楼
keepon
5楼2013-03-22 08:44:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

monazhou001

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-03-22 08:44:16
楼主。。。我最近也遇见同样的问题，你的问题解决了么？我普通PCR也能Ｐ出来的。。从来没遇见过这样的问题。。。有人说是仪器的那几个孔出现问题了。。我正在郁闷中。有人说叫我重新设计引物。。你的解决了么？

没有。。昨天刚刚做第一次，出现了这种问题
普通PCR能P出来不应该是引物的问题吧？
我本身以为是buffer出了问题，可是用跑完荧光的体系跑电泳也可以跑出来，SYBR又很灵敏，所以我感觉会不会是模板浓度太高造成的。。。
可是我的CT值那张图没出现任何峰
赞一下 回复此楼
6楼2013-03-22 08:51:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
monazhou001: 金币+12, ★★★很有帮助, 非常感谢 2013-03-22 18:12:47
引用回帖:
6楼: Originally posted by monazhou001 at 2013-03-22 08:51:42
没有。。昨天刚刚做第一次，出现了这种问题
普通PCR能P出来不应该是引物的问题吧？
我本身以为是buffer出了问题，可是用跑完荧光的体系跑电泳也可以跑出来，SYBR又很灵敏，所以我感觉会不会是模板浓度太高造成的 ...

我做了两次。。。两次都是同一个基因没有检测出来。。ＣＴ值那张图也没有任何峰。模板第一次用的是２ｕｌ。第二次我就只加了１ｕｌ，可是还是不能检测出来，我在怀疑是不是这个基因本身的表达就很低，所以检测不出来，我反倒认为是模板量太少了。。你认为呢？
赞一下 回复此楼
keepon
7楼2013-03-22 09:00:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

monazhou001

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-03-22 09:00:43
我做了两次。。。两次都是同一个基因没有检测出来。。ＣＴ值那张图也没有任何峰。模板第一次用的是２ｕｌ。第二次我就只加了１ｕｌ，可是还是不能检测出来，我在怀疑是不是这个基因本身的表达就很低，所以检测不出 ...

你其他基因都可以出来么？那我感觉你这个可能是引物的问题吧？
你其他体系里都是cDNA当模板么，多少的量呢？
赞一下 回复此楼
8楼2013-03-22 09:17:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhlf1989513

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by monazhou001 at 2013-03-22 09:17:45
你其他基因都可以出来么？那我感觉你这个可能是引物的问题吧？
你其他体系里都是cDNA当模板么，多少的量呢？...

对的。。都是相同的体系，就是引物不一样而已。。但是普通ＰＣＲ是可以Ｐ出来的。我严重怀疑该基因本身表达量就很低。。
赞一下 回复此楼
keepon
9楼2013-03-22 10:31:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

monazhou001

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-03-22 10:31:06
对的。。都是相同的体系，就是引物不一样而已。。但是普通ＰＣＲ是可以Ｐ出来的。我严重怀疑该基因本身表达量就很低。。...

你当时有测cDNA浓度么？20体系加了多少呢？
我的师兄曾经用相同的引物可以测出来，但是他现在不在实验室了，他说是可能cDNA浓度太高造成的，不过他不记得他当时的体系了
赞一下 回复此楼
10楼2013-03-22 11:34:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 monazhou001 的主题更新
191/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 290调剂生物0860 +35 哇哈哈，。 2026-04-11 41/2050 2026-04-14 23:47 by Xurambo2014
[考研] 求调剂推荐 +4 小聂爱学习 2026-04-14 4/200 2026-04-14 20:54 by fqwang
[考研] 材料类284调剂 +41 想换手机不想解� 2026-04-08 49/2450 2026-04-14 17:53 by lhj2009
[考研] 297，工科调剂? +6 河南农业大学-能 2026-04-14 6/300 2026-04-14 16:04 by Art1977
[考研] 279学硕食品专业求调剂院校 20+6 孤独的狼爱吃羊 2026-04-12 28/1400 2026-04-14 15:44 by zs92450
[考研] 271求调剂 +35 2261744733 2026-04-11 41/2050 2026-04-14 15:36 by zs92450
[考研] 293求调剂 +16 我爱高数高数爱� 2026-04-12 18/900 2026-04-13 21:47 by 学员JpLReM
[考研] 生物学调剂，一志愿西南大学348，Top期刊一区二作、二区三作，三等奖学金三次 +5 candyyyi 2026-04-09 5/250 2026-04-13 09:02 by 可淡不可忘
[考研] 314求调剂 +24 wakeluofu 2026-04-09 25/1250 2026-04-13 08:58 by lhj2009
[考研] 化工调剂求导师收留！一志愿失利，踏实肯干，有植物提取科研经历 +20 yzyzx 2026-04-09 21/1050 2026-04-12 00:12 by 小小小小啦啦啦
[考研] 调剂求助 +6 果然有我 2026-04-11 7/350 2026-04-11 16:22 by 明月此时有
[考研] 一志愿985机械学硕380求调剂 +5 关关雎鸠10 2026-04-11 5/250 2026-04-11 10:10 by 知念。A
[考研] 346，工科求调剂 +3 moser233 2026-04-09 3/150 2026-04-11 10:04 by zhq0425
[考研] 337求调剂 +4 研s. 2026-04-10 4/200 2026-04-11 08:57 by zhq0425
[论文投稿] mdpi小修rvr时间四五天了 20+3 哈哈high 2026-04-08 5/250 2026-04-10 16:02 by 北京莱茵润色
[考研] 296求调剂 +6 汪！？！ 2026-04-08 6/300 2026-04-10 11:02 by mattzhming
[考研] 青岛科技大学材料学院，环境学院调剂补录4月10日以前都可以 +3 1青科大。 2026-04-09 5/250 2026-04-10 09:58 by 翩翩一书生
[论文投稿] 求助文献原文 10+3 18500821399 2026-04-08 3/150 2026-04-09 16:56 by 北京莱茵润色
[考研] 调剂 +12 月@163.com 2026-04-08 12/600 2026-04-09 14:27 by rl1980
[考研] 0860004 求调剂 309分 +6 Yin DY 2026-04-09 6/300 2026-04-09 10:19 by 啊李999
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭