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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)

[求助] 求高人指点 3‘RACE 急急急

3’RACE总是做不出来 现在PCR有条带 在一千bp处有一条带 700左右有一条带 但是都很暗 剩下就是200bp有带很亮有拖尾   我觉得1000bp可能是目的条带 但是胶回收很困难 我的程序是94度3min 94度 30s 68度45s 72度 2min 25个循环   反应体系是12.2ul水 2ulbuffer 1.6 ul dNTPs 1ul特异引物 1ul模板 2ulUPM引物   请问怎么样才能然我那个1000bp条带亮一些啊!!!!真的很着急 很上火
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 遥望87 at 2013-03-21 10:41:21
你可以把循环数增加一些,比如到30个循环,循环结束后再72℃延伸7min左右,另外你是20μL体系吗?如果是的话你的酶加0.2μL,是不是有些少(不知道你用的酶的单位是多少),可以增大体系,多加一些酶。

噢 为什么延伸7min? 那我下次试着把酶多加点 谢谢啦
5楼2013-03-22 10:29:51
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遥望87

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
yoyo单眼皮: 金币+2, ★有帮助 2013-03-22 10:31:02
你可以把循环数增加一些,比如到30个循环,循环结束后再72℃延伸7min左右,另外你是20μL体系吗?如果是的话你的酶加0.2μL,是不是有些少(不知道你用的酶的单位是多少),可以增大体系,多加一些酶。
夜空中最亮的星!
2楼2013-03-21 10:41:21
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jk_xdx

银虫 (小有名气)

用的是哪个公司的酶?
3楼2013-03-21 16:41:53
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jiapingshk

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你可以改变一下PCR程序,第一个循环把退火设低一点,比如50度,然后每一个程序退火都提高一度,直到你目前的退火为止,随后的循环中退火不变,循环数可以多一些,但是不要超过35。
4楼2013-03-21 18:01:42
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