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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求高人指点 3‘RACE 急急急
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)

[求助] 求高人指点 3‘RACE 急急急

3’RACE总是做不出来 现在PCR有条带 在一千bp处有一条带 700左右有一条带 但是都很暗 剩下就是200bp有带很亮有拖尾   我觉得1000bp可能是目的条带 但是胶回收很困难 我的程序是94度3min 94度 30s 68度45s 72度 2min 25个循环   反应体系是12.2ul水 2ulbuffer 1.6 ul dNTPs 1ul特异引物 1ul模板 2ulUPM引物   请问怎么样才能然我那个1000bp条带亮一些啊！！！！真的很着急 很上火
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1楼 2013-03-21 09:44:51
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jiapingshk

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你可以改变一下PCR程序，第一个循环把退火设低一点，比如50度，然后每一个程序退火都提高一度，直到你目前的退火为止，随后的循环中退火不变，循环数可以多一些，但是不要超过35。
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4楼2013-03-21 18:01:42
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遥望87

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yoyo单眼皮: 金币+2, ★有帮助 2013-03-22 10:31:02
你可以把循环数增加一些，比如到30个循环，循环结束后再72℃延伸7min左右，另外你是20μL体系吗？如果是的话你的酶加0.2μL，是不是有些少（不知道你用的酶的单位是多少），可以增大体系，多加一些酶。
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夜空中最亮的星！
2楼2013-03-21 10:41:21
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jk_xdx

银虫 (小有名气)
用的是哪个公司的酶？
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3楼2013-03-21 16:41:53
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 遥望87 at 2013-03-21 10:41:21
你可以把循环数增加一些，比如到30个循环，循环结束后再72℃延伸7min左右，另外你是20μL体系吗？如果是的话你的酶加0.2μL，是不是有些少（不知道你用的酶的单位是多少），可以增大体系，多加一些酶。

噢 为什么延伸7min? 那我下次试着把酶多加点 谢谢啦
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5楼2013-03-22 10:29:51
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