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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白表达分子量偏大
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Phyrce

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 田甜思 at 2013-03-14 15:37:17
是这样的，我的理论值是70KD,但是在脚上的为止已经有120KD了，还有一个样品的理论值是37KD，胶上就是四十多了，还有请教一下蛋白序列的亲疏水性怎么判别呢...

请问下你这两个蛋白是分别跑的胶么？
如果跑分子量大的蛋白，可以用浓度低点的胶， 这样会比较准确。不然来不及扩展开就电泳停了。

蛋白中氨基酸，非极性多的表现为疏水，极性多的表现为亲水。
一般蛋白内部以非极性氨基酸为主，外部会多点极性的。
如果要准确预测，有软件可以算序列的物理特性的。详细你可以上ExPASy 看看
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11楼2013-03-14 17:25:32
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Phyrce

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by 田甜思 at 2013-03-14 15:47:24
MS 是什么？...

MS是质谱的简称 mass spectrum
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12楼2013-03-14 17:26:45
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jackhua17

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
13楼2013-03-15 02:19:33
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tigertang

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-10 13:14:13
1.如果你是在动物细胞里表达重组蛋白，因为翻译后修饰的存在（如磷酸化、乙酰化、泛素化等），蛋白比预测大一点比较正常，如果特别纠结，加一个原核表达的蛋白作为对照（去除标签）

2. 也有一些跟预测大小差别比较大的情况，如人的SIRT1，预测82kd左右，western Blot检测癌细胞一般接近120kd

所以建议你参考你研究蛋白的文献、抗体公司提供的datasheet，综合考量分析原因。
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14楼2013-03-15 09:22:31
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zhua666

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的蛋白是不是糖蛋白？如果是糖蛋白，糖基化修饰会造成蛋白分子量比根据氨基酸预测分子量大
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15楼2013-03-15 09:25:18
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zyx335588

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
9楼: Originally posted by 田甜思 at 2013-03-14 15:37:17
是这样的，我的理论值是70KD,但是在脚上的为止已经有120KD了，还有一个样品的理论值是37KD，胶上就是四十多了，还有请教一下蛋白序列的亲疏水性怎么判别呢...

理论值70kD，在胶上120kD肯定不正常的；37kD，在胶上40多kD还是可以接受的。要想确定是不是你的蛋白，最好一下肽谱鉴定。
提醒一下楼主注意克隆时终止密码子问题
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16楼2013-03-15 13:18:54
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zyx335588

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by 田甜思 at 2013-03-14 15:47:24
MS 是什么？...

mass spectrum，通过质谱确定精确的分子量，但是对于确认一个蛋白是不是你的目标蛋白，证据并不充分。因为你在表达纯化中可能存在降解、截短等，因此还是建议你通过质谱做一下肽指纹来鉴定
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17楼2013-03-15 13:23:55
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田甜思

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by Phyrce at 2013-03-14 17:25:32
请问下你这两个蛋白是分别跑的胶么？
如果跑分子量大的蛋白，可以用浓度低点的胶， 这样会比较准确。不然来不及扩展开就电泳停了。

蛋白中氨基酸，非极性多的表现为疏水，极性多的表现为亲水。
一般蛋白内部以 ...

不是分别跑的，是在同一块胶上的，但是我分开跑的时候也是偏大的
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18楼2013-03-16 11:13:30
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田甜思

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by zyx335588 at 2013-03-15 13:23:55
mass spectrum，通过质谱确定精确的分子量，但是对于确认一个蛋白是不是你的目标蛋白，证据并不充分。因为你在表达纯化中可能存在降解、截短等，因此还是建议你通过质谱做一下肽指纹来鉴定...

我是做过WB 的 有条带，所以应该就是我的目的条带，现在只是偏大的问题 还有就是我老师说要我做变性电泳，可是我现在做的SDS-PAGE就是啊，还有别热什么方法使蛋白质变性么？
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19楼2013-03-16 11:20:17
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田甜思

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by zhua666 at 2013-03-15 09:25:18
你的蛋白是不是糖蛋白？如果是糖蛋白，糖基化修饰会造成蛋白分子量比根据氨基酸预测分子量大

不是糖蛋白呀，而且我是在大肠杆菌中表达的，是原核表达系统，一般不会形成糖基化吧
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20楼2013-03-16 11:25:27
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