[交流] 蛋白体液中加甘油和蔗糖的作用是什么？已有3人参与

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1楼2013-03-10 11:51:14

rice1007

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2楼2013-03-10 13:41:22

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2楼: Originally posted by rice1007 at 2013-03-10 13:41:22
我个人觉得，这两个东东主要是密度大，上样电泳时起到沉降作用的哟，不至于蛋白上样时飘起来。

蛋白比他俩沉吧。。。

3楼2013-03-10 13:51:28

rice1007

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4楼2013-03-10 13:55:01

cicelyzh

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主要是维持一定的渗透压，有助于破碎细胞。你提取蛋白的时候是在native条件下把，一般要求冰上操作，蔗糖和甘油在低温下对蛋白有一定的保护作用，稳定蛋白结构。甘油有类似膜脂的结构，所以在分离纯化大分子膜蛋白的时候往往加甘油的效果更好。

5楼2013-03-10 15:21:20

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4楼: Originally posted by rice1007 at 2013-03-10 13:55:01
没有啊，我是搞水稻，我一般蛋白电泳都是加甘油（20%），起沉降作用，跑DNA我一般都是加蔗糖。...

我试试

6楼2013-03-10 15:35:29

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5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-10 15:21:20
主要是维持一定的渗透压，有助于破碎细胞。你提取蛋白的时候是在native条件下把，一般要求冰上操作，蔗糖和甘油在低温下对蛋白有一定的保护作用，稳定蛋白结构。甘油有类似膜脂的结构，所以在分离纯化大分子膜蛋白的 ...

为什么是稳定蛋白结构呢，提取蛋白时，不是要断开二硫键、氢键等次级键，破坏掉它的结构吗？
这是步骤：
将材料加液氮研碎成粉末状，加入少许PVP-40及含50mMTris-HCl(pH7．8)、10％v/v加甘油、1mM EDTANa2、lmM PMSF和2％v/v巯基乙醇的抽提缓冲液I继续匀浆。
沉淀再用含有100mM磷酸缓冲液(pH7．1)、10％v/v甘油、200mM KCl、2mM MgS04.7H2O、1mM EDTANa2、2％w/V CHAPs、1mM PMSF和2％v/v巯基乙醇的抽提缓冲液Ⅱ悬浮起来。
轻轻摇匀30min后，加入7M Urea、2M硫脲、3mM DTT在室温继
续摇匀30min。再22400rpm离心3 min，取上清与上次所得上清液汇合。
对上清液中的总蛋白质进行酚抽提，加入等体积Tris饱和酚，振荡30min。再离心3min，15000rpm，4℃。取酚相再加入5倍体积0.1M乙酸胺(甲醇配制)，4℃静置至出现沉淀为止。离心30min，15000rpm，4℃。用丙酮(含13mMDTT)洗涤两次。最后，-40℃冰冻干燥蛋白质成干粉状。
求指教！

7楼2013-03-10 17:19:18

rice1007

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8楼2013-03-10 22:44:46

cicelyzh

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7楼: Originally posted by 湖畔狂想 at 2013-03-10 17:19:18
为什么是稳定蛋白结构呢，提取蛋白时，不是要断开二硫键、氢键等次级键，破坏掉它的结构吗？
这是步骤：
将材料加液氮研碎成粉末状，加入少许PVP-40及含50mMTris-HCl(pH7．8)、10％v/v加甘油、1mM EDTANa2、lmM ...

感觉你的方法是要上2D吧。我说的是总体上的目的。有些方法是不加尿素、DTT、CHAPS这些东西的。
就你的这个方法，加甘油的目的是能更充分的提取膜蛋白。因为膜蛋白是镶嵌在脂双层里面，一定的甘油能给膜蛋白一个相对稳定的微环境。

9楼2013-03-11 01:18:21

湖畔狂想

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9楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-11 01:18:21
感觉你的方法是要上2D吧。我说的是总体上的目的。有些方法是不加尿素、DTT、CHAPS这些东西的。
就你的这个方法，加甘油的目的是能更充分的提取膜蛋白。因为膜蛋白是镶嵌在脂双层里面，一定的甘油能给膜蛋白一个相 ...

嗯，是要上2D。
能说说你用的方法吗？

10楼2013-03-11 08:12:10