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kinglovecw铜虫 (小有名气)
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[求助]
求助EGFP蛋白的western及免疫荧光问题！！！！！急急急！！！！！已有1人参与
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小弟最近构建了一个EGFP融合表达的蛋白，转染293T细胞以后，DAPI染色然后共聚焦观察其在细胞内的定位。可是发现荧光很快就粹灭了，根本无法拍照，用p-EFGP-N3空载体的话好一些。我的实验过程是：0.4%多聚甲醛固定10分钟，0.1 triton 透膜5分钟，DAPI染色20分钟，期间都是PBS清洗三遍。不知道问题出在哪里！ 再就是用RIPA强裂解细胞提取总蛋白，用试剂盒分离核和质蛋白后进行western实验，发现总蛋白中无法检测到EGFP，试剂盒提取的核与质蛋白又可以，不知是否是RIPA强导致的EGFP的降解。 先谢谢各位大神了！！！！！！！ [ Last edited by wizardfan on 2013-3-7 at 08:12 ] |
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5楼2014-03-13 14:56:04
2楼2013-03-06 17:33:27
曾文正公
金虫 (著名写手)
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【答案】应助回帖
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kinglovecw: 金币+5, ★有帮助 2013-03-09 19:54:02
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kinglovecw: 金币+5, ★有帮助 2013-03-09 19:54:02
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我们通常做染色是这样的，4% （不是0.4%）的多聚甲醛（pH7.2-7.4）室温固定15min,PBS洗两次，0.1% triton in PBS室温打孔5min，PBS洗一次，DAPI染色5min，PBS洗两次，就可以看了，如果是玻片的话还需要封片。提醒一下，GFP在酸性环境下荧光会淬灭的。 你WB方面的问题确实很奇怪，GFP是很稳定的，不应该连wb都做不出来。如果你怀疑你的RIPA，那你就从小木虫上找个RIPA配方自己配一下，RIPA这东西真觉得没必要买，自己配的比卖的好多了。希望能帮到你，祝好 |
3楼2013-03-06 17:51:01
kinglovecw
铜虫 (小有名气)
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4楼2013-03-09 19:53:00