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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助EGFP蛋白的western及免疫荧光问题！！！！！急急急！！！！！
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kinglovecw

铜虫 (小有名气)

[求助] 求助EGFP蛋白的western及免疫荧光问题！！！！！急急急！！！！！ 已有1人参与

小弟最近构建了一个EGFP融合表达的蛋白，转染293T细胞以后，DAPI染色然后共聚焦观察其在细胞内的定位。可是发现荧光很快就粹灭了，根本无法拍照，用p-EFGP-N3空载体的话好一些。我的实验过程是：0.4%多聚甲醛固定10分钟，0.1 triton 透膜5分钟，DAPI染色20分钟，期间都是PBS清洗三遍。不知道问题出在哪里！

再就是用RIPA强裂解细胞提取总蛋白，用试剂盒分离核和质蛋白后进行western实验，发现总蛋白中无法检测到EGFP，试剂盒提取的核与质蛋白又可以，不知是否是RIPA强导致的EGFP的降解。

先谢谢各位大神了！！！！！！！

[ Last edited by wizardfan on 2013-3-7 at 08:12 ]
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想多么简单就多么简单！
1楼 2013-03-06 16:54:09
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jiejiewutong

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2013-03-07 08:13:07
有那种防荧光淬灭的试剂，你可以试试看！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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得之，我幸；失之。我命
2楼2013-03-06 17:33:27
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曾文正公

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+3, 谢谢分享经验 2013-03-07 08:12:47
kinglovecw: 金币+5, ★有帮助 2013-03-09 19:54:02
我们通常做染色是这样的，4% （不是0.4%）的多聚甲醛（pH7.2-7.4）室温固定15min,PBS洗两次，0.1% triton in PBS室温打孔5min，PBS洗一次，DAPI染色5min，PBS洗两次，就可以看了，如果是玻片的话还需要封片。提醒一下，GFP在酸性环境下荧光会淬灭的。

你WB方面的问题确实很奇怪，GFP是很稳定的，不应该连wb都做不出来。如果你怀疑你的RIPA，那你就从小木虫上找个RIPA配方自己配一下，RIPA这东西真觉得没必要买，自己配的比卖的好多了。希望能帮到你，祝好
赞一下 回复此楼
只有非常努力，才能看起来毫不费力
3楼2013-03-06 17:51:01
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kinglovecw

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 曾文正公 at 2013-03-06 17:51:01
我们通常做染色是这样的，4% （不是0.4%）的多聚甲醛（pH7.2-7.4）室温固定15min,PBS洗两次，0.1% triton in PBS室温打孔5min，PBS洗一次，DAPI染色5min，PBS洗两次，就可以看了，如果是玻片的话还需要封片。提醒一 ...

不好意思最近很忙，忘记看了。我想可能与PH值，温度也有一定关系，我下次改冰上固定染色试试吧，western不知用SDS裂解效果怎么样。
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想多么简单就多么简单！
4楼2013-03-09 19:53:00
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johnnyr78

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
5楼2014-03-13 14:56:04
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