| 查看: 2768 | 回复: 4 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
kinglovecw铜虫 (小有名气)
|
[求助]
求助EGFP蛋白的western及免疫荧光问题！！！！！急急急！！！！！ 已有1人参与
|
|
|
小弟最近构建了一个EGFP融合表达的蛋白，转染293T细胞以后，DAPI染色然后共聚焦观察其在细胞内的定位。可是发现荧光很快就粹灭了，根本无法拍照，用p-EFGP-N3空载体的话好一些。我的实验过程是：0.4%多聚甲醛固定10分钟，0.1 triton 透膜5分钟，DAPI染色20分钟，期间都是PBS清洗三遍。不知道问题出在哪里！ 再就是用RIPA强裂解细胞提取总蛋白，用试剂盒分离核和质蛋白后进行western实验，发现总蛋白中无法检测到EGFP，试剂盒提取的核与质蛋白又可以，不知是否是RIPA强导致的EGFP的降解。 先谢谢各位大神了！！！！！！！ [ Last edited by wizardfan on 2013-3-7 at 08:12 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
Western Blot电泳蛋白质外漏问题求助
已经有22人回复
- 【求助/交流】请教大分子量蛋白western blot转膜的一些问题
已经有10人回复
- 【求助/交流】极小分子与极大分子蛋白的Western Bloting转膜求助！
已经有10人回复
kinglovecw
铜虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 587
- 散金: 40
- 红花: 7
- 帖子: 65
- 在线: 43.3小时
- 虫号: 1293719
- 注册: 2011-05-12
- 专业: 细胞增殖、生长与分化
4楼2013-03-09 19:53:00
2楼2013-03-06 17:33:27
曾文正公
金虫 (著名写手)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 4564.3
- 红花: 6
- 帖子: 1936
- 在线: 626.5小时
- 虫号: 2161228
- 注册: 2012-12-02
- 性别: GG
- 专业: 神经生物学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+3, 谢谢分享经验 2013-03-07 08:12:47
kinglovecw: 金币+5, ★有帮助 2013-03-09 19:54:02
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+3, 谢谢分享经验 2013-03-07 08:12:47
kinglovecw: 金币+5, ★有帮助 2013-03-09 19:54:02
|
我们通常做染色是这样的，4% （不是0.4%）的多聚甲醛（pH7.2-7.4）室温固定15min,PBS洗两次，0.1% triton in PBS室温打孔5min，PBS洗一次，DAPI染色5min，PBS洗两次，就可以看了，如果是玻片的话还需要封片。提醒一下，GFP在酸性环境下荧光会淬灭的。 你WB方面的问题确实很奇怪，GFP是很稳定的，不应该连wb都做不出来。如果你怀疑你的RIPA，那你就从小木虫上找个RIPA配方自己配一下，RIPA这东西真觉得没必要买，自己配的比卖的好多了。希望能帮到你，祝好 |
3楼2013-03-06 17:51:01
|
本帖内容被屏蔽 |
5楼2014-03-13 14:56:04
