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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 超滤更换buffer时损失非常大
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haniel01

铜虫 (初入文坛)

[求助] 超滤更换buffer时损失非常大

如题，用超滤管更换buffer,原来是tris缓冲液的pH是7.9要换成7.2的PBS缓冲液，每次超滤完后损失都将近70%蛋白都没有了，流出液中也没有就是吸附在膜上也弄不下来非常的烦恼蛋白得来不易啊有没有什么办法解决这个问题呢？求助求助啊
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1楼 2013-03-06 11:11:08
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xiaomai1215

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-03-06 17:07:24
70%太大了
1.是不是蛋白的总量就比较少，损失大
2.注意蛋白的等电点等性质，更换过程中，蛋白是否发生了聚集沉淀，要经常混匀避免底部浓度过大
3.使用低吸附超滤膜
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haniel01
2楼2013-03-06 13:15:59
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2013-03-06 17:07:34
所以很多时候，我宁可通过透析来换缓冲液，几乎没啥损失。要是非得用超滤的话，你最后是倒过来低速离心下来的？还是不倒过来，直接吸取上面的液体的？那种可以倒过来低速离心取得最终样品的还好一些。
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haniel01
3楼2013-03-06 14:01:44
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haniel01

铜虫 (初入文坛)
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引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaomai1215 at 2013-03-06 13:15:59
70%太大了
1.是不是蛋白的总量就比较少，损失大
2.注意蛋白的等电点等性质，更换过程中，蛋白是否发生了聚集沉淀，要经常混匀避免底部浓度过大
3.使用低吸附超滤膜

总量不算少吧 本来有3mg多的蛋白 超滤完后1mg都没有了，底部浓度过大的话是会吸附在膜上吗？我用的是millipore的，不过不是新的用过几次了跟这个有关系吗？谢谢
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4楼2013-03-06 14:03:49
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haniel01

铜虫 (初入文坛)
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引用回帖:
3楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-03-06 14:01:44
所以很多时候，我宁可通过透析来换缓冲液，几乎没啥损失。要是非得用超滤的话，你最后是倒过来低速离心下来的？还是不倒过来，直接吸取上面的液体的？那种可以倒过来低速离心取得最终样品的还好一些。

不能倒过来离心，就是直接取上面的液体我都有吸打，用透析袋换的话是不是还要换液几次啊？没有做过这个
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5楼2013-03-06 14:29:17
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

透析袋我一般换三次，其中有一次是过夜的，剩下两次是4 h左右。反正透析就是时间长点，但是对蛋白损失不太大。
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haniel01
6楼2013-03-06 14:56:07
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xiaomai1215

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

底部浓度大可能使蛋白形成胶体状，而且影响速度。也容易是蛋白发生聚集沉淀，也可能使损失加大。还有，如果可以换个新的超滤管，会不会是膜漏了？
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haniel01
7楼2013-03-06 15:47:07
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haniel01

铜虫 (初入文坛)
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引用回帖:
6楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-03-06 14:56:07
透析袋我一般换三次，其中有一次是过夜的，剩下两次是4 h左右。反正透析就是时间长点，但是对蛋白损失不太大。

这样啊， 那请问一般体系做多大呢？谢谢
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8楼2013-03-06 16:20:48
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haniel01

铜虫 (初入文坛)
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引用回帖:
7楼: Originally posted by xiaomai1215 at 2013-03-06 15:47:07
底部浓度大可能使蛋白形成胶体状，而且影响速度。也容易是蛋白发生聚集沉淀，也可能使损失加大。还有，如果可以换个新的超滤管，会不会是膜漏了？

那就是蛋白浓度稍微低点吸附会少点是这样吗？不会是膜漏了因为我也测了流出液几乎没什么蛋白
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9楼2013-03-06 16:21:50
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我一般都用4L的大烧杯，呵呵。透析液用个3-4L，不过也看你的液体体积多大呀
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haniel01
10楼2013-03-06 16:27:34
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