应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 紧急求助！细胞免疫荧光染色失败，细胞、试剂、抗体全换了还是做不出来
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
101/1返回列表
查看: 5515  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

cyjen

新虫 (初入文坛)

[求助] 紧急求助！细胞免疫荧光染色失败，细胞、试剂、抗体全换了还是做不出来

细胞是IMCD3细胞，小鼠肾上皮纤毛细胞。之前从一家国内公司订的细胞，染得出骨架，染不出纤毛。这次换了新细胞，是师兄从进口细胞库订的，培养基是GIBCO的1640. 胰酶也是GIBCO的。一抗是小鼠单抗α-tubulin，染细胞骨架和纤毛；二抗是invitrogen的荧光二抗，红色荧光，goat抗mouse.

我是4%PFA固定15min，20%羊血清室温封闭半小时，一抗过夜，二抗过夜。一抗稀释比例做过1:1000,1:800 protocol推荐1：1000就行。二抗按1:1000做。

染出来在显微镜下面什么都看不到，一片红茫茫的，分不清背景跟细胞。期间一抗换了新的，从PBS、PFA到羊血清全部重新配了，做过37℃快染和过夜慢染，一次结果都没有。好想哭。。。。求大神解救！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白质生物学实验经验

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-01-23 16:58:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

conanzzz

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
过夜是4度过夜？尝试过BSA封闭不？另外要不拿个别的细胞先试试，如果单纯就是背景高应该要加大封闭吧
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2013-01-23 18:09:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cyjen

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by conanzzz at 2013-01-23 18:09:49
过夜是4度过夜？尝试过BSA封闭不？另外要不拿个别的细胞先试试，如果单纯就是背景高应该要加大封闭吧

嗯，一抗二抗都是4度过夜。BSA没试过，倒不是背景高而是完全没有染上色的细胞。。因为曝光时间已经很长很长了。你说的加大封闭，那我封闭过夜可以么？
倒是可以拿293细胞试试神马的。
赞一下 回复此楼
3楼2013-01-23 19:10:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cyjen

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by conanzzz at 2013-01-23 18:09:49
过夜是4度过夜？尝试过BSA封闭不？另外要不拿个别的细胞先试试，如果单纯就是背景高应该要加大封闭吧

另外，我还拿别的一抗染过这个细胞，3个标记膜蛋白的抗体。
一样的步骤，染出来了的。
赞一下 回复此楼
4楼2013-01-23 19:13:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

conanzzz

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by cyjen at 2013-01-23 19:10:53
嗯，一抗二抗都是4度过夜。BSA没试过，倒不是背景高而是完全没有染上色的细胞。。因为曝光时间已经很长很长了。你说的加大封闭，那我封闭过夜可以么？
倒是可以拿293细胞试试神马的。...

不是很了解，但是感觉如果不是背景高而是没染上，而且别的一抗染没问题，是不是调一下一抗稀释比呢？多做几个浓度？
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2013-01-23 20:57:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
别的一抗一样的步骤染这个细胞没问题的话
基本上就是一抗的问题了
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2013-01-24 00:17:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cyjen

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-24 00:17:09
别的一抗一样的步骤染这个细胞没问题的话
基本上就是一抗的问题了

我现在纠结了！我用另外一种细胞染色，用一样的一抗二抗，一样的实验条件，唯一不同的是二抗过了两个晚上才洗的。染出来了！
赞一下 回复此楼
7楼2013-01-28 10:48:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cyjen

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by conanzzz at 2013-01-23 18:09:49
过夜是4度过夜？尝试过BSA封闭不？另外要不拿个别的细胞先试试，如果单纯就是背景高应该要加大封闭吧

我现在纠结了！我用另外一种细胞染色，用一样的一抗二抗，一样的实验条件，唯一不同的是二抗过了两个晚上才洗的。染出来了！
赞一下 回复此楼
8楼2013-01-28 10:49:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Tesoro_P

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cyjen at 2013-01-28 10:49:17
我现在纠结了！我用另外一种细胞染色，用一样的一抗二抗，一样的实验条件，唯一不同的是二抗过了两个晚上才洗的。染出来了！...

请教一下，你最后封闭和通透的时间都怎么设定的？？？
赞一下 回复此楼
9楼2013-04-07 21:05:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

一抗1:100看看，做个western检验一抗是否好用
赞一下 回复此楼
10楼2013-11-14 20:04:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 cyjen 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 284求调剂 +3 小熊～～ 2026-03-31 3/150 2026-03-31 07:25 by jp9609
[考研] 环境工程 085701，267求调剂 +8 minht 2026-03-29 8/400 2026-03-31 03:32 by 蒙奇奇521
[考研] 材料工程专硕求调剂 +8 hyl3153942 2026-03-29 8/400 2026-03-30 20:45 by dophin1985
[考研] 一志愿华中师范化学332分求调剂 +3 Lyy930824@ 2026-03-29 3/150 2026-03-30 20:15 by DHUSHUAI
[考研] 一志愿南开大学0710生物学359求调剂 +5 兔兔兔111223314 2026-03-29 7/350 2026-03-30 18:29 by 兔兔兔111223314
[考研] 322求调剂：一志愿湖南大学 材料与化工（085600），已过六级。 +9 XX小邓 2026-03-29 9/450 2026-03-30 17:18 by limeifeng
[考研] 070300化学354求调剂 +7 101次希望 2026-03-28 7/350 2026-03-30 13:22 by Iveryant
[考研] 0703化学/290求调剂/本科经历丰富/工科也可 +13 丹青奶盖 2026-03-26 15/750 2026-03-30 12:35 by fangnagu
[考研] 环境科学与工程334分求调剂 +6 王一一依依 2026-03-30 8/400 2026-03-30 11:52 by yjolah
[考研] 085602 307分 求调剂 +7 不知道叫什么！ 2026-03-26 7/350 2026-03-28 09:57 by 神马都不懂
[考研] 275求调剂 +10 jjjjjjjjjjl 2026-03-27 10/500 2026-03-27 23:47 by barnett0632
[考研] 085600，材料与化工321分，求调剂 +9 大馋小子 2026-03-27 9/450 2026-03-27 14:30 by mmm just
[考研] 材料求调剂 +5 .m.. 2026-03-25 5/250 2026-03-27 11:08 by 不吃魚的貓
[考研] 调剂 +4 柚柚yoyo 2026-03-26 4/200 2026-03-26 20:43 by fmesaito
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +3 崔wj 2026-03-26 3/150 2026-03-26 19:57 by nihaoar
[考研] 材料调剂 5+4 想要一壶桃花水 2026-03-25 10/500 2026-03-26 19:56 by 不吃魚的貓
[考研] 281求调剂 +6 Koxui 2026-03-24 7/350 2026-03-26 15:37 by 无际的草原
[考研] 材料与化工304求B区调剂 +3 邱gl 2026-03-25 3/150 2026-03-25 19:03 by Ainin_
[考研] 302求调剂 +4 锦衣卫藤椒 2026-03-25 4/200 2026-03-25 16:29 by 功夫疯狂
[考研] 调剂 +4 13853210211 2026-03-24 4/200 2026-03-24 19:44 by ms629
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭