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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 紧急求助！细胞免疫荧光染色失败，细胞、试剂、抗体全换了还是做不出来
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cyjen

新虫 (初入文坛)

[求助] 紧急求助！细胞免疫荧光染色失败，细胞、试剂、抗体全换了还是做不出来

细胞是IMCD3细胞，小鼠肾上皮纤毛细胞。之前从一家国内公司订的细胞，染得出骨架，染不出纤毛。这次换了新细胞，是师兄从进口细胞库订的，培养基是GIBCO的1640. 胰酶也是GIBCO的。一抗是小鼠单抗α-tubulin，染细胞骨架和纤毛；二抗是invitrogen的荧光二抗，红色荧光，goat抗mouse.

我是4%PFA固定15min，20%羊血清室温封闭半小时，一抗过夜，二抗过夜。一抗稀释比例做过1:1000,1:800 protocol推荐1：1000就行。二抗按1:1000做。

染出来在显微镜下面什么都看不到，一片红茫茫的，分不清背景跟细胞。期间一抗换了新的，从PBS、PFA到羊血清全部重新配了，做过37℃快染和过夜慢染，一次结果都没有。好想哭。。。。求大神解救！
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1楼 2013-01-23 16:58:15
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cyjen

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by conanzzz at 2013-01-23 18:09:49
过夜是4度过夜？尝试过BSA封闭不？另外要不拿个别的细胞先试试，如果单纯就是背景高应该要加大封闭吧

嗯，一抗二抗都是4度过夜。BSA没试过，倒不是背景高而是完全没有染上色的细胞。。因为曝光时间已经很长很长了。你说的加大封闭，那我封闭过夜可以么？
倒是可以拿293细胞试试神马的。
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3楼2013-01-23 19:10:53
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conanzzz

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
过夜是4度过夜？尝试过BSA封闭不？另外要不拿个别的细胞先试试，如果单纯就是背景高应该要加大封闭吧
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2楼2013-01-23 18:09:49
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cyjen

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by conanzzz at 2013-01-23 18:09:49
过夜是4度过夜？尝试过BSA封闭不？另外要不拿个别的细胞先试试，如果单纯就是背景高应该要加大封闭吧

另外，我还拿别的一抗染过这个细胞，3个标记膜蛋白的抗体。
一样的步骤，染出来了的。
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4楼2013-01-23 19:13:54
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conanzzz

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by cyjen at 2013-01-23 19:10:53
嗯，一抗二抗都是4度过夜。BSA没试过，倒不是背景高而是完全没有染上色的细胞。。因为曝光时间已经很长很长了。你说的加大封闭，那我封闭过夜可以么？
倒是可以拿293细胞试试神马的。...

不是很了解，但是感觉如果不是背景高而是没染上，而且别的一抗染没问题，是不是调一下一抗稀释比呢？多做几个浓度？
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5楼2013-01-23 20:57:24
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