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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 哪位熟悉枯草杆菌表达系统前辈，来帮忙解决一下小妹的实验啊！做不完怎么过年啊！！！
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alice

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 哪位熟悉枯草杆菌表达系统前辈，来帮忙解决一下小妹的实验啊！做不完怎么过年啊！！！

本人做一个大黄欧文菌来源的蔗糖异构酶的表达，这基因已经在大肠杆菌里表达过了，想在枯草杆菌里表达，用的PHY300的穿梭质粒做载体，加了P43的启动子，构建时P43和目的基因之间加入一个酶切位点，现在转化完成，质粒双酶切验证正确。但37度下表达两天后仍测不到酶活，哪位前辈以前做过的，可不可以给指导下我的问题是出在哪了？是本身异源表达有问题，还是载体的问题，还是表达条件的问题？？？马上要放假了，研究生最后一年，不想过年回来还纠结这些实验啊………………
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To be strong enough
1楼 2013-01-16 19:21:05
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alice

铁杆木虫 (正式写手)
朋友们一帮帮忙啊，急问啊！
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To be strong enough
2楼2013-01-16 20:24:29
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scienzyme

铁杆木虫 (著名写手)
你是要分泌表达吗？用了什么信号肽？还是在胞内表达？
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3楼2013-01-16 20:35:01
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alice

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by scienzyme at 2013-01-16 20:35:01
你是要分泌表达吗？用了什么信号肽？还是在胞内表达？

是想分泌表达，用的别人构建好的一段P43后面直接加上的nprB信号肽序列，各种未知，着急呢……
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To be strong enough
4楼2013-01-17 09:52:57
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alice

铁杆木虫 (正式写手)
做过枯草异源表达的能不能帮忙给个建议啊？急呢……
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To be strong enough
5楼2013-01-17 13:14:50
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23ct

新虫 (初入文坛)
友情帮楼主顶一下.
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6楼2013-01-17 13:35:53
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dmzha

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
alice: 金币+5, ★有帮助, 嗯，这个问题已经出现过了，也解决了，但现在还是测不到酶活，你有经验吧？可不可以给提示下需要注意的地方？ 2013-01-17 21:59:38
引用回帖:
4楼: Originally posted by alice at 2013-01-17 09:52:57
是想分泌表达，用的别人构建好的一段P43后面直接加上的nprB信号肽序列，各种未知，着急呢……...

设计引物的时候要注意不能发生移码突变，否则表达的蛋白是没有活性的。
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7楼2013-01-17 14:49:24
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scienzyme

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
alice: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢啊！不过我们对枯草的系统真的不了解，身边的人没有很丰富的经验，文章里的信息也不多，您可不可以给提供个更多了解枯草的途径呢？ 2013-01-17 22:01:54
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-23 16:05:11
枯草杆菌分泌表达有两种系统，Sec和Tat。nprB信号肽属于Sec系统。Tat分泌系统近年来受到重视，具有一些Sec系统没有的优点。但是无论哪个系统，都不能保证你的目的产物一定能够分泌成功。
遇到分泌失败，首先要检查序列是否正确，有没有破坏阅读框；然后就是换信号肽，Sec系统和Tat系统的信号肽都可以尝试一下。
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8楼2013-01-17 21:26:11
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scienzyme

铁杆木虫 (著名写手)
推荐你看一下这篇文章 http://aem.asm.org/content/74/24/7507.short
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9楼2013-01-17 21:36:18
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alice

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 23ct at 2013-01-17 13:35:53
友情帮楼主顶一下.

谢谢啊
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To be strong enough
10楼2013-01-17 21:58:23
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