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alice

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 哪位熟悉枯草杆菌表达系统前辈,来帮忙解决一下小妹的实验啊!做不完怎么过年啊!!!

本人做一个大黄欧文菌来源的蔗糖异构酶的表达,这基因已经在大肠杆菌里表达过了,想在枯草杆菌里表达,用的PHY300的穿梭质粒做载体,加了P43的启动子,构建时P43和目的基因之间加入一个酶切位点,现在转化完成,质粒双酶切验证正确。但37度下表达两天后仍测不到酶活,哪位前辈以前做过的,可不可以给指导下我的问题是出在哪了?是本身异源表达有问题,还是载体的问题,还是表达条件的问题???马上要放假了,研究生最后一年,不想过年回来还纠结这些实验啊………………
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dmzha

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
alice: 金币+5, 有帮助, 嗯,这个问题已经出现过了,也解决了,但现在还是测不到酶活,你有经验吧?可不可以给提示下需要注意的地方? 2013-01-17 21:59:38
引用回帖:
4楼: Originally posted by alice at 2013-01-17 09:52:57
是想分泌表达,用的别人构建好的一段P43后面直接加上的nprB信号肽序列,各种未知,着急呢……...

设计引物的时候要注意不能发生移码突变,否则表达的蛋白是没有活性的。
7楼2013-01-17 14:49:24
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alice

铁杆木虫 (正式写手)

朋友们一帮帮忙啊,急问啊!
To be strong enough
2楼2013-01-16 20:24:29
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scienzyme

铁杆木虫 (著名写手)

你是要分泌表达吗?用了什么信号肽?还是在胞内表达?
3楼2013-01-16 20:35:01
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alice

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by scienzyme at 2013-01-16 20:35:01
你是要分泌表达吗?用了什么信号肽?还是在胞内表达?

是想分泌表达,用的别人构建好的一段P43后面直接加上的nprB信号肽序列,各种未知,着急呢……
To be strong enough
4楼2013-01-17 09:52:57
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