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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 要愁死了，求帮助，筛选转化子的问题
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cdmmore

铜虫 (小有名气)

[求助] 要愁死了，求帮助，筛选转化子的问题

将目的基因导入pET28a，选了8个单克隆做菌落PCR能P出来，但是提质粒后，用目的基因上的酶切位点酶切，居然切不断，大小和空质粒一样，怎么回事呀？我的目的基因到底有没有导进去？
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1楼 2013-01-04 14:33:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by cdmmore at 2013-01-07 16:47:40
谢谢，学习啦，下次换引物试试。
可是我还是没有明白为什么两个引物都在目标基因上不好呢？如果说是假阳性高，我这是特异性引物呀，难道还能从空载体上扩出跟我目标基因大小一样的条带？...

理论上是没有问题。但实际操作上，往往模板是最容易污染的，尤其是克隆做多了慢慢就会理解的。总之，PCR的时候注意做对照，便于分析结果。
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13楼2013-01-08 07:39:26
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
cdmmore: 金币+1, ★有帮助 2013-01-04 15:50:21
一切以酶切结果为准，你是切不开呢，还是切开了，但是大小与空质粒一样，如果是后者的话，很明显，没有导进去，菌落PCR假阳性.
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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
2楼2013-01-04 15:17:58
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
cdmmore: 金币+1, ★有帮助 2013-01-04 15:50:33
菌落PCR有假阳性的，既然提质粒酶切鉴定不符合，肯定是不对的，要么多筛，要么从新克隆。
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3楼2013-01-04 15:32:52
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cdmmore

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Marado at 2013-01-04 15:17:58
一切以酶切结果为准，你是切不开呢，还是切开了，但是大小与空质粒一样，如果是后者的话，很明显，没有导进去，菌落PCR假阳性.

是切不开。请教一下菌落PCR怎么来的假阳性呢，我挑了8个克隆都能P出来，但都切不开
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4楼2013-01-04 15:49:47
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