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一步一步

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by royhahaha at 2013-02-19 08:36:31
我最后做出来的结果是我所标记的抗体发生非特异性反应了。
不知道因为溶NHS-Biotin用的是DMSO（150微升），最后总的标记混合液体积是5ml左右的缓冲液。
不知道虫友知道为什么是什么导致抗体变性的么？（我的抗体 ...

你的抗体发生非特异性反应指的是什么？？
NHS-Biotin必须用有机试剂溶解的，用DMSO或者DMF都没有问题。单抗或者多抗都不会都什么问题。
你要是说抗体变性，我想问一下，你用DMSO将NHS-Biotin溶解成了多大的浓度啊？？
你能不能把具体步骤发上来看看？？
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11楼2013-02-19 08:54:19
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royhahaha

木虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 一步一步 at 2013-02-19 08:54:19
你的抗体发生非特异性反应指的是什么？？
NHS-Biotin必须用有机试剂溶解的，用DMSO或者DMF都没有问题。单抗或者多抗都不会都什么问题。
你要是说抗体变性，我想问一下，你用DMSO将NHS-Biotin溶解成了多大的浓度啊 ...

我的过程是这样的：
1、先将单抗IgG 5g溶于5ml的 PH7.4的PBS缓冲液
2、称600微克的NHS-Biotin溶于150微升的DMSO中
3、然后在磁力搅拌的条件下，将NHS-Biotin的DMSO溶液加入到5ml的PBS缓冲液中，进行生物素标记反应。
4、反应40-60min后进行透析处理。
如果你有什么好的意见请直接提出来啊。  多谢啦

我说的抗体变性是指：因为标记的是单抗，我们用水、血清、血浆作为样本反应，结果水没反应，血清和血浆都有反应。而抗原是血浆中才有的，血清中基本没有的。故初步判断，是出现了抗体变性。导致了非特异行反应。
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12楼2013-02-19 16:47:37
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一步一步

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by royhahaha at 2013-02-19 16:47:37
我的过程是这样的：
1、先将单抗IgG 5g溶于5ml的 PH7.4的PBS缓冲液
2、称600微克的NHS-Biotin溶于150微升的DMSO中
3、然后在磁力搅拌的条件下，将NHS-Biotin的DMSO溶液加入到5ml的PBS缓冲液中，进行生物素标记反 ...

你的那个判断说实话我没有理解。
针对你的步骤我有点疑问：
1. 你的单抗应该是已经纯化得到的对吧？
2. 你的单抗是5克溶于5mlPBS中？抗体浓度是1G/ml？你确定？？
3. 你的生物素浓度是4mg/ml？没错吧？
你先把你的单位解释一下吧，如果是1g/ml的抗体与600ug的生物素反应的话，应该是标记率很低的。如果抗体浓度是1mg/ml的话还可以考虑下。但是建议你把生物素浓度调整至10mg/ml.
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13楼2013-02-20 08:49:42
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royhahaha

木虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 一步一步 at 2013-02-20 08:49:42
你的那个判断说实话我没有理解。
针对你的步骤我有点疑问：
1. 你的单抗应该是已经纯化得到的对吧？
2. 你的单抗是5克溶于5mlPBS中？抗体浓度是1G/ml？你确定？？
3. 你的生物素浓度是4mg/ml？没错吧？
你先把 ...

1、单抗是买国外的，进过纯化的。
2、不好意思，这个抗体单位是输错了。应该是单抗5mg溶于5ml的PBS缓冲液中。 最后抗体溶液是1mg/ml。
3、对的，生物素浓度是4mg/ml（溶于DMSO中）。
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14楼2013-02-20 10:55:55
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royhahaha

木虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 一步一步 at 2013-02-20 08:49:42
你的那个判断说实话我没有理解。
针对你的步骤我有点疑问：
1. 你的单抗应该是已经纯化得到的对吧？
2. 你的单抗是5克溶于5mlPBS中？抗体浓度是1G/ml？你确定？？
3. 你的生物素浓度是4mg/ml？没错吧？
你先把 ...

我们要测定的抗原是在血浆中的，血清中基本不含有的。就像是D-D聚体一样，血浆中含有，血清中没有。
我标记完生物素，就经行了检测，结果血清和血浆都有了反应，就水没有反应。故现在初步判断抗体发生了变性。
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15楼2013-02-20 11:00:03
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小小乖宝宝

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by royhahaha at 2013-02-19 08:36:31
我最后做出来的结果是我所标记的抗体发生非特异性反应了。
不知道因为溶NHS-Biotin用的是DMSO（150微升），最后总的标记混合液体积是5ml左右的缓冲液。
不知道虫友知道为什么是什么导致抗体变性的么？（我的抗体 ...

不好意思，放假回家了。今天才看到。我生物素标记的抗体还不错，特异性蛮明显的。就是生物素与蛋白以分子量1:20标记，透析一天一夜，然后。对了，你抗体透析前有没有除去叠氮化钠
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16楼2013-02-20 16:36:57
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一步一步

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by 小小乖宝宝 at 2013-02-20 16:36:57
不好意思，放假回家了。今天才看到。我生物素标记的抗体还不错，特异性蛮明显的。就是生物素与蛋白以分子量1:20标记，透析一天一夜，然后。对了，你抗体透析前有没有除去叠氮化钠...

标记前透析一次就行的，不用提前除去。有的文献中海提到，叠氮化钠在一定浓度（小于等于3mM）下对标记不会有影响的。所以这个应该不是主要问题。当然如果你害怕有影响的话，在标记前多透析下就是了。
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17楼2013-02-21 08:40:47
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一步一步

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by royhahaha at 2013-02-20 11:00:03
我们要测定的抗原是在血浆中的，血清中基本不含有的。就像是D-D聚体一样，血浆中含有，血清中没有。
我标记完生物素，就经行了检测，结果血清和血浆都有了反应，就水没有反应。故现在初步判断抗体发生了变性。...

既然水中没有反应，那你为什么不怀疑血清中含有你要测定的抗原呢？？当然血浆中成分可能更复杂，我不是很了解，只是存在这个疑问。
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18楼2013-02-21 08:42:56
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royhahaha

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by 小小乖宝宝 at 2013-02-20 16:36:57
不好意思，放假回家了。今天才看到。我生物素标记的抗体还不错，特异性蛮明显的。就是生物素与蛋白以分子量1:20标记，透析一天一夜，然后。对了，你抗体透析前有没有除去叠氮化钠...

我们买的抗体是固态的。一起来的质检报告里面说明了，里面不含有叠氮钠，只含有少量的NaCl。 所以我在标记前就没有进行透析除叠氮钠的过程了。 直接溶解标记生物素了。
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19楼2013-02-21 08:48:11
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royhahaha

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by 小小乖宝宝 at 2013-02-20 16:36:57
不好意思，放假回家了。今天才看到。我生物素标记的抗体还不错，特异性蛮明显的。就是生物素与蛋白以分子量1:20标记，透析一天一夜，然后。对了，你抗体透析前有没有除去叠氮化钠...

虫友你看我标记的过程有问题么？
能否告知我你的标记过程呢。 可以的话 大谢啊
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20楼2013-02-21 08:49:12
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