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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 表达的蛋白质偏小
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Tporker

金虫 (小有名气)

[求助] 表达的蛋白质偏小

最近表达的蛋白质总是偏小，不知道是何原因？大肠杆菌表达，质粒的序列进行测序，没有位点突变，并且完整。表达后的菌体收集冷冻直至进行破碎，通过镍柱和麦芽糖柱纯化以后，进行SDS-PAGE，发现纯化的蛋白质大小偏小。哪位大侠给帮帮忙，分析下会是哪方面的原因？感激不尽
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值，夜渐浓，闻窗外蛙鸣，辗转无眠难入梦；此，风渐清，听庭内雨应，悱恻浮醒忆青笼。
1楼 2012-12-11 09:27:23
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

yeyu541200

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我在一次博士生答辩的时候，好像听到一个答辩委员说过，六个组氨酸会影响蛋白的条带位置，可能会比原来的小上一点，但不会很大！
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9楼2012-12-13 10:46:07
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
SDS-PAGE下的表观分子量与理论值不符的情况时有发生。因为SDS-PAGE除了有分子筛效应以外，还有电荷效应。从胶上看小不一定真的就是分子量小。不用太纠结。
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2楼2012-12-11 11:31:01
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aaa6239

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也遇到了
我还以为是信号肽被切除所致。后来请教高手，人家说也可能是蛋白修饰或者电荷差异所致。
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3楼2012-12-11 15:25:02
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Tporker

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-11 11:31:01
SDS-PAGE下的表观分子量与理论值不符的情况时有发生。因为SDS-PAGE除了有分子筛效应以外，还有电荷效应。从胶上看小不一定真的就是分子量小。不用太纠结。

变性胶，跑出来是两条带，一条大小正好，另一条偏小20KD且为主条带。进行活性测试，发现活性很低，基本是1U/μL或2U/μL
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值，夜渐浓，闻窗外蛙鸣，辗转无眠难入梦；此，风渐清，听庭内雨应，悱恻浮醒忆青笼。
4楼2012-12-11 15:27:02
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by Tporker at 2012-12-11 15:27:02
变性胶，跑出来是两条带，一条大小正好，另一条偏小20KD且为主条带。进行活性测试，发现活性很低，基本是1U/μL或2U/μL...

你检查一下构建的载体上除了目的基因的ATG以外附近是不是还有其他ATG。有时候由于克隆原因可能出现其他转录起点而造成有不同的表达蛋白出来。
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5楼2012-12-12 08:03:05
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muchong5577

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
蛋白在SDS胶上的表观分子量，关于这个问题，有两篇文献曾报道过，内容跟2. 3 楼讲得差不多，希望对你有帮助。
1. Brady L, et al, Nature，1990,343:767-770
2.唐威华等，植物生理学报，2000,26：64-68
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6楼2012-12-12 09:27:18
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
偏差不是太大的话，应该是可以的
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7楼2012-12-12 11:01:47
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wchuangqi

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我觉得那条大小正好的带可能是你的目的条带，那个小点的很可能是目的条带的降解，我没看到你的图所以不能确定。另外你用的麦芽糖洗脱的，应该是MBP标签的蛋白吧。那个小的会不会是MBP本身？如果是Mbp标签的话，就不会是镍柱了吧？
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天道酬勤
8楼2012-12-12 15:40:20
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Tporker

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by yeyu541200 at 2012-12-13 10:46:07
我在一次博士生答辩的时候，好像听到一个答辩委员说过，六个组氨酸会影响蛋白的条带位置，可能会比原来的小上一点，但不会很大！

哦，谢谢，知道了
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值，夜渐浓，闻窗外蛙鸣，辗转无眠难入梦；此，风渐清，听庭内雨应，悱恻浮醒忆青笼。
10楼2012-12-13 15:12:02
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