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淘气维尼89

木虫 (小有名气)

[求助] RT-PCR求助

最近在做RT-PCR，使用的材料是实验室自己诱导培养的植物愈伤组织，提取RNA之后，逆转录合成cDNA，以此为模板进行PCR。扩增过500bp左右的基因，以及1500bp左右的基因，都没有扩出来条带。将cDNA稀释10倍后，500bp的基因片段扩出来了，但是空白对照也有条带。并且带孔不干净，感觉有东西没跑出来似的。请大家帮帮忙分析一下问题出在哪，别的老师说问题可能有两个方面：一是RNA质量不好。二是选择的细胞不好，有退化，所以大片段就扩不出来

这是1500bp的基因，没有目的条带



这是500bp的基因，有目的条带，最右边是空白对照
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1楼2012-10-30 18:42:16
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涌动的泉

铜虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
会不会是引物的问题？
如果担心RNA质量不好的话，提完RNA时可以抽一俩组跑个琼脂糖凝胶看看
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我们的过去，成就了如今的我们，无需悔恨
2楼2012-10-30 19:10:59
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caoxin1984

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-31 15:20:23
淘气维尼89: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-11-01 16:07:24
1500bp的没有条带，建议
1. 在NCBI验证一下引物是否正确，是否是你要P的目的基因
2. 选择一个阳标，即确定该基因表达的组织

500bp虽然P出来了，但是条带很弱，建议
1. 加大每孔上样量
2. 改变EB或GelRed等的浓度

空白条带有显示，一般是因为加样污染导致，建议每次加样时更换枪头，最好用带滤芯的枪头

祝好运！
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3楼2012-10-30 19:49:25
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淘气维尼89

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by caoxin1984 at 2012-10-30 19:49:25
1500bp的没有条带，建议
1. 在NCBI验证一下引物是否正确，是否是你要P的目的基因
2. 选择一个阳标，即确定该基因表达的组织

500bp虽然P出来了，但是条带很弱，建议
1. 加大每孔上样量
2. 改变EB或GelRed等的 ...

谢谢，引物以前就用过的，应该没有问题；阳性对照我下次会找一个合适的
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4楼2012-10-30 20:08:14
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淘气维尼89

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 涌动的泉 at 2012-10-30 19:10:59
会不会是引物的问题？
如果担心RNA质量不好的话，提完RNA时可以抽一俩组跑个琼脂糖凝胶看看

谢谢您的回复，引物以前就用过的，没有问题你；RNA电泳后带型还是比较清楚的，做逆转录应该没问题
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5楼2012-10-30 20:10:02
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david1008gao

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
先用cDNA做模板扩一下ACTIN看看吧 ，循环数不要太高。
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6楼2012-10-30 23:18:14
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-31 15:20:34
淘气维尼89: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-11-01 16:07:41
1.首先保证你的RNA没有问题，比如通过OD的比值、RNA浓度以及电泳检测；
2.如果RNA没问题就要做个内参的PCR，以确认逆转录操作以及试剂没问题；
3.NCBI验证引物的特异性。
以上所有结果都是肯定的，如果仍是扩增不出来就要考虑操作问题以及模板本身的复杂二级结构等原因。
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7楼2012-10-31 08:24:42
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你测过cDNA的浓度吗？
还有PCR体系有没有问题？
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生物化学与分子生物学
8楼2012-10-31 08:32:25
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huangguoqing

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助，热心的虫虫 2012-10-31 15:20:50
淘气维尼89: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-11-01 16:07:55
个人建议，仅供参考！
1.不是十分同意楼上所说的污染说法，如果仅仅是污染条带不会这么清晰；
2.建议你查一下你要的mRNA占总mRNA的比例，然后调整PCR时加cDNA的量；
3.500bp的虽然出现了条带，但个人感觉不是你想要的东西，可以胶回收你要的那条带，然后用胶回收产物做模板二次PCR或者克隆测序检验一下；
4.选用适合扩增长片段的逆转录酶，或者在RT的时候更换随机引物或者特异性引物进行RT，且要注意RT温度的变化；
5.点样孔那里出现的白色条带可能是PCR体系里的聚合酶等蛋白或buffer里面的一些盐造成的。
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9楼2012-10-31 09:41:15
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xiaoyi-1988

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-31 15:21:01
淘气维尼89: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-11-01 16:08:04
如果你的cDNA没问题的话，可能是因为你的1500左右的基因的表达量低本身不好扩，一般情况下扩2000以内的CDNA是很容易扩的。以前我就遇到过这种情况。建议再提一次RNA，提高RNA的质量再看看。
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风雨无悔，踏踏实实走好人生路上的每一步。
10楼2012-10-31 10:03:51
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