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淘气维尼89木虫 (小有名气)
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[求助]
RT-PCR求助
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最近在做RT-PCR，使用的材料是实验室自己诱导培养的植物愈伤组织，提取RNA之后，逆转录合成cDNA，以此为模板进行PCR。扩增过500bp左右的基因，以及1500bp左右的基因，都没有扩出来条带。将cDNA稀释10倍后，500bp的基因片段扩出来了，但是空白对照也有条带。并且带孔不干净，感觉有东西没跑出来似的。请大家帮帮忙分析一下问题出在哪，别的老师说问题可能有两个方面：一是RNA质量不好。二是选择的细胞不好，有退化，所以大片段就扩不出来 这是1500bp的基因，没有目的条带  这是500bp的基因，有目的条带，最右边是空白对照 |
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huangguoqing
木虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助，热心的虫虫 2012-10-31 15:20:50
淘气维尼89: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-11-01 16:07:55
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个人建议，仅供参考！ 1.不是十分同意楼上所说的污染说法，如果仅仅是污染条带不会这么清晰； 2.建议你查一下你要的mRNA占总mRNA的比例，然后调整PCR时加cDNA的量； 3.500bp的虽然出现了条带，但个人感觉不是你想要的东西，可以胶回收你要的那条带，然后用胶回收产物做模板二次PCR或者克隆测序检验一下； 4.选用适合扩增长片段的逆转录酶，或者在RT的时候更换随机引物或者特异性引物进行RT，且要注意RT温度的变化； 5.点样孔那里出现的白色条带可能是PCR体系里的聚合酶等蛋白或buffer里面的一些盐造成的。 |
9楼2012-10-31 09:41:15