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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR求助
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淘气维尼89

木虫 (小有名气)

[求助] RT-PCR求助

最近在做RT-PCR，使用的材料是实验室自己诱导培养的植物愈伤组织，提取RNA之后，逆转录合成cDNA，以此为模板进行PCR。扩增过500bp左右的基因，以及1500bp左右的基因，都没有扩出来条带。将cDNA稀释10倍后，500bp的基因片段扩出来了，但是空白对照也有条带。并且带孔不干净，感觉有东西没跑出来似的。请大家帮帮忙分析一下问题出在哪，别的老师说问题可能有两个方面：一是RNA质量不好。二是选择的细胞不好，有退化，所以大片段就扩不出来

这是1500bp的基因，没有目的条带



这是500bp的基因，有目的条带，最右边是空白对照
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1楼 2012-10-30 18:42:16
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淘气维尼89

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by caoxin1984 at 2012-10-30 19:49:25
1500bp的没有条带，建议
1. 在NCBI验证一下引物是否正确，是否是你要P的目的基因
2. 选择一个阳标，即确定该基因表达的组织

500bp虽然P出来了，但是条带很弱，建议
1. 加大每孔上样量
2. 改变EB或GelRed等的 ...

谢谢，引物以前就用过的，应该没有问题；阳性对照我下次会找一个合适的
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4楼2012-10-30 20:08:14
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涌动的泉

铜虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
会不会是引物的问题？
如果担心RNA质量不好的话，提完RNA时可以抽一俩组跑个琼脂糖凝胶看看
赞一下 回复此楼
我们的过去，成就了如今的我们，无需悔恨
2楼2012-10-30 19:10:59
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caoxin1984

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-31 15:20:23
淘气维尼89: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-11-01 16:07:24
1500bp的没有条带，建议
1. 在NCBI验证一下引物是否正确，是否是你要P的目的基因
2. 选择一个阳标，即确定该基因表达的组织

500bp虽然P出来了，但是条带很弱，建议
1. 加大每孔上样量
2. 改变EB或GelRed等的浓度

空白条带有显示，一般是因为加样污染导致，建议每次加样时更换枪头，最好用带滤芯的枪头

祝好运！
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3楼2012-10-30 19:49:25
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淘气维尼89

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 涌动的泉 at 2012-10-30 19:10:59
会不会是引物的问题？
如果担心RNA质量不好的话，提完RNA时可以抽一俩组跑个琼脂糖凝胶看看

谢谢您的回复，引物以前就用过的，没有问题你；RNA电泳后带型还是比较清楚的，做逆转录应该没问题
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5楼2012-10-30 20:10:02
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