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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR求助
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淘气维尼89

木虫 (小有名气)

[求助] RT-PCR求助

最近在做RT-PCR，使用的材料是实验室自己诱导培养的植物愈伤组织，提取RNA之后，逆转录合成cDNA，以此为模板进行PCR。扩增过500bp左右的基因，以及1500bp左右的基因，都没有扩出来条带。将cDNA稀释10倍后，500bp的基因片段扩出来了，但是空白对照也有条带。并且带孔不干净，感觉有东西没跑出来似的。请大家帮帮忙分析一下问题出在哪，别的老师说问题可能有两个方面：一是RNA质量不好。二是选择的细胞不好，有退化，所以大片段就扩不出来

这是1500bp的基因，没有目的条带



这是500bp的基因，有目的条带，最右边是空白对照
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1楼 2012-10-30 18:42:16
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-31 15:20:34
淘气维尼89: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-11-01 16:07:41
1.首先保证你的RNA没有问题，比如通过OD的比值、RNA浓度以及电泳检测；
2.如果RNA没问题就要做个内参的PCR，以确认逆转录操作以及试剂没问题；
3.NCBI验证引物的特异性。
以上所有结果都是肯定的，如果仍是扩增不出来就要考虑操作问题以及模板本身的复杂二级结构等原因。
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7楼2012-10-31 08:24:42
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涌动的泉

铜虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
会不会是引物的问题？
如果担心RNA质量不好的话，提完RNA时可以抽一俩组跑个琼脂糖凝胶看看
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我们的过去，成就了如今的我们，无需悔恨
2楼2012-10-30 19:10:59
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caoxin1984

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-31 15:20:23
淘气维尼89: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-11-01 16:07:24
1500bp的没有条带，建议
1. 在NCBI验证一下引物是否正确，是否是你要P的目的基因
2. 选择一个阳标，即确定该基因表达的组织

500bp虽然P出来了，但是条带很弱，建议
1. 加大每孔上样量
2. 改变EB或GelRed等的浓度

空白条带有显示，一般是因为加样污染导致，建议每次加样时更换枪头，最好用带滤芯的枪头

祝好运！
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3楼2012-10-30 19:49:25
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淘气维尼89

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by caoxin1984 at 2012-10-30 19:49:25
1500bp的没有条带，建议
1. 在NCBI验证一下引物是否正确，是否是你要P的目的基因
2. 选择一个阳标，即确定该基因表达的组织

500bp虽然P出来了，但是条带很弱，建议
1. 加大每孔上样量
2. 改变EB或GelRed等的 ...

谢谢，引物以前就用过的，应该没有问题；阳性对照我下次会找一个合适的
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4楼2012-10-30 20:08:14
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