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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 22.0kD-3.3kD小分子marker跑Tricine胶，7.8,5.8和3.3的条带出不来，帮忙分析一下吧
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遥控器68

金虫 (小有名气)

[求助] 22.0kD-3.3kD小分子marker跑Tricine胶，7.8,5.8和3.3的条带出不来，帮忙分析一下吧

问题如帖子标题所说，请大家帮忙解决下~先谢过了 图片大 只好附件了 请不要嫌麻烦，相互学习嘛~
图1    S是样品；M是80、60、40、30、20、12kD的marker；m是solarbio的超低分子量蛋白marker，箭头从上到下分别是22.0、14.4kD两条带，最后的三条7.8、5.8和3.3kD的就没有出来，仅有第三个箭头部分模糊的一片。m使用前按照说明书加热处理。图2   在跑的过程中照的，开跑没多久m就开始挤占它两边loading buffer的泳道。图3 是06年nature上的那张图，我不要求那么清晰的，只要后边三条带全分开就好，起码能发挥点儿marker应有的作用。
1.胶浓度原因？这张用的12.5%tricine胶，16%Urea，20%urea的也跑过了，都是m下面的三个低分子的跑不出来。
2.上样量不够？曾经考虑上样量的问题，觉得8μL，10μL可能不够，后来用了16μL，对于marker来说相当大了，图左边的M也就用了4μL。（这个15T的蛋白marker建议分装10μL）
3. 跑胶时间长，小肽出去了？溴酚蓝留了3cm没让出去，后来为了排除这个原因，separating gel时间也是比往常少1-2h，跑胶过程中的温度控制没问题,可是情况未改变。
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1楼 2012-10-30 11:29:59
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉是你小分子量marker不行，胶看起来还好，样品小于12kD分出了几条带，虽然不是特别sharp。这个胶没加尿素吧？至于marker挤占两边的泳道问题，可能是你上marker前没有稀释在与样品相同体积的蛋白上样buffer里的缘故。顺便问一下，你用的什么染色？怎么绿色背景的，搞得文件那么大。
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2楼2012-10-30 12:28:32
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遥控器68

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-30 12:28:32
感觉是你小分子量marker不行，胶看起来还好，样品小于12kD分出了几条带，虽然不是特别sharp。这个胶没加尿素吧？至于marker挤占两边的泳道问题，可能是你上marker前没有稀释在与样品相同体积的蛋白上样buffer里的缘 ...

marker用过几次效果也不怎么样，如果有人想用超低分子的一定不推荐这个了。
胶里加尿素了，所以提到了控温。
染色用的CBB R250，推荐说是G250，但是订的还没送到，R250应急了。
只是您所说的marker稀释那点没有明白意思，还请再描述下。
谢谢！
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3楼2012-10-30 14:40:09
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验 2012-10-31 08:00:30
引用回帖:
3楼: Originally posted by 遥控器68 at 2012-10-30 14:40:09
marker用过几次效果也不怎么样，如果有人想用超低分子的一定不推荐这个了。
胶里加尿素了，所以提到了控温。
染色用的CBB R250，推荐说是G250，但是订的还没送到，R250应急了。
只是您所说的marker稀释那点没有 ...

比方说你要上5ul marker（已经在loading buffer里的），你的蛋白样品上样体积是20ul(10ul样品+10ul上样buffer), 你需要把5ul的marker加上5ul上样buffer补足到样品上样buffer含量。
我也用R250染过Tricine胶，没什么问题啊？
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遥控器68
4楼2012-10-31 06:38:40
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遥控器68

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-31 06:38:40
比方说你要上5ul marker（已经在loading buffer里的），你的蛋白样品上样体积是20ul(10ul样品+10ul上样buffer), 你需要把5ul的marker加上5ul上样buffer补足到样品上样buffer含量。
我也用R250染过Tricine胶，没什 ...

今天上样会试试您所说的，看看效果。
R250染色就是脱色慢，其他没什么问题的。
我想条带出不来还有种可能，推测是固定上的问题，今天也要鉴定一下。
谢谢你啦~
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5楼2012-10-31 08:58:29
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 遥控器68 at 2012-10-31 08:58:29
今天上样会试试您所说的，看看效果。
R250染色就是脱色慢，其他没什么问题的。
我想条带出不来还有种可能，推测是固定上的问题，今天也要鉴定一下。
谢谢你啦~...

考染一般不用特别去固定，因为染液和脱色液都有甲醇、醋酸。如果想脱色快一些，可以在脱色时容器的一角放一小块无尘纸用来吸附脱色液中的染料。
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6楼2012-10-31 10:19:55
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遥控器68

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-31 10:19:55
考染一般不用特别去固定，因为染液和脱色液都有甲醇、醋酸。如果想脱色快一些，可以在脱色时容器的一角放一小块无尘纸用来吸附脱色液中的染料。...

脱色时候最好不用甲醇，容易脱过。小分子的会不会脱色时候丢了呢？
无尘纸的方法没试过，刚跑上一块胶，下次用了。好用的就吸收一下，哈哈，先谢过啦~
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7楼2012-10-31 11:14:01
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wizardfan: 金币+3, 热心人奖励 2012-11-01 08:04:17
引用回帖:
7楼: Originally posted by 遥控器68 at 2012-10-31 11:14:01
脱色时候最好不用甲醇，容易脱过。小分子的会不会脱色时候丢了呢？
无尘纸的方法没试过，刚跑上一块胶，下次用了。好用的就吸收一下，哈哈，先谢过啦~...

会不会脱过要看脱色液中甲醇的含量，低浓度甲醇的脱色液需要的时间长，但不会脱过。
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8楼2012-11-01 06:11:10
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遥控器68

金虫 (小有名气)
★
yqbter: 金币+1, 鼓励发帖！ 2012-11-01 19:01:37
请问用的多少浓度的木有问题？条带跑出来了，脱色用了10%乙酸，还是留有一些背景的。
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9楼2012-11-01 13:18:44
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 遥控器68 at 2012-11-01 13:18:44
请问用的多少浓度的木有问题？条带跑出来了，脱色用了10%乙酸，还是留有一些背景的。

我一般用25%甲醇+7%乙酸。如果怕脱过的话，可以用7%甲醇+5%乙酸，脱过夜也没事。有一点背景没关系，直接放水里过夜就能把背景基本除去。大概是胶里面的少量甲醇和乙酸缓慢透出把最后一点背景也可以除干净。
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10楼2012-11-01 14:21:12
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