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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 22.0kD-3.3kD小分子marker跑Tricine胶，7.8,5.8和3.3的条带出不来，帮忙分析一下吧
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遥控器68

金虫 (小有名气)

[求助] 22.0kD-3.3kD小分子marker跑Tricine胶，7.8,5.8和3.3的条带出不来，帮忙分析一下吧

问题如帖子标题所说，请大家帮忙解决下~先谢过了 图片大 只好附件了 请不要嫌麻烦，相互学习嘛~
图1    S是样品；M是80、60、40、30、20、12kD的marker；m是solarbio的超低分子量蛋白marker，箭头从上到下分别是22.0、14.4kD两条带，最后的三条7.8、5.8和3.3kD的就没有出来，仅有第三个箭头部分模糊的一片。m使用前按照说明书加热处理。图2   在跑的过程中照的，开跑没多久m就开始挤占它两边loading buffer的泳道。图3 是06年nature上的那张图，我不要求那么清晰的，只要后边三条带全分开就好，起码能发挥点儿marker应有的作用。
1.胶浓度原因？这张用的12.5%tricine胶，16%Urea，20%urea的也跑过了，都是m下面的三个低分子的跑不出来。
2.上样量不够？曾经考虑上样量的问题，觉得8μL，10μL可能不够，后来用了16μL，对于marker来说相当大了，图左边的M也就用了4μL。（这个15T的蛋白marker建议分装10μL）
3. 跑胶时间长，小肽出去了？溴酚蓝留了3cm没让出去，后来为了排除这个原因，separating gel时间也是比往常少1-2h，跑胶过程中的温度控制没问题,可是情况未改变。
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    • 2012-10-30 10:57:28, 1.05 M
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1楼 2012-10-30 11:29:59
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遥控器68

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-31 06:38:40
比方说你要上5ul marker（已经在loading buffer里的），你的蛋白样品上样体积是20ul(10ul样品+10ul上样buffer), 你需要把5ul的marker加上5ul上样buffer补足到样品上样buffer含量。
我也用R250染过Tricine胶，没什 ...

今天上样会试试您所说的，看看效果。
R250染色就是脱色慢，其他没什么问题的。
我想条带出不来还有种可能，推测是固定上的问题，今天也要鉴定一下。
谢谢你啦~
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5楼2012-10-31 08:58:29
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉是你小分子量marker不行，胶看起来还好，样品小于12kD分出了几条带，虽然不是特别sharp。这个胶没加尿素吧？至于marker挤占两边的泳道问题，可能是你上marker前没有稀释在与样品相同体积的蛋白上样buffer里的缘故。顺便问一下，你用的什么染色？怎么绿色背景的，搞得文件那么大。
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2楼2012-10-30 12:28:32
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遥控器68

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-30 12:28:32
感觉是你小分子量marker不行，胶看起来还好，样品小于12kD分出了几条带，虽然不是特别sharp。这个胶没加尿素吧？至于marker挤占两边的泳道问题，可能是你上marker前没有稀释在与样品相同体积的蛋白上样buffer里的缘 ...

marker用过几次效果也不怎么样，如果有人想用超低分子的一定不推荐这个了。
胶里加尿素了，所以提到了控温。
染色用的CBB R250，推荐说是G250，但是订的还没送到，R250应急了。
只是您所说的marker稀释那点没有明白意思，还请再描述下。
谢谢！
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3楼2012-10-30 14:40:09
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验 2012-10-31 08:00:30
引用回帖:
3楼: Originally posted by 遥控器68 at 2012-10-30 14:40:09
marker用过几次效果也不怎么样，如果有人想用超低分子的一定不推荐这个了。
胶里加尿素了，所以提到了控温。
染色用的CBB R250，推荐说是G250，但是订的还没送到，R250应急了。
只是您所说的marker稀释那点没有 ...

比方说你要上5ul marker（已经在loading buffer里的），你的蛋白样品上样体积是20ul(10ul样品+10ul上样buffer), 你需要把5ul的marker加上5ul上样buffer补足到样品上样buffer含量。
我也用R250染过Tricine胶，没什么问题啊？
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遥控器68
4楼2012-10-31 06:38:40
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