| 查看: 1599 | 回复: 3 | ||
[求助]
小分子（9KD）Trincine 胶且戊二醛固定后的转膜条件
|
最近在做一种脂肪因子apelin，一抗购自abcam，第一次做的时候撞大运，用20％的SDS-PAGE做出来一个条带（非常不清晰），后来增大一抗浓度，延长或者减少转膜时间（一直为湿转，200mA恒流），但是目的条带再也没出现过，最近改用了TRICINE胶，跑胶后戊二醛固定，转膜条件为：湿转，200mA，1个小时。增大上样量为50ug/孔，低温条件，分离胶之前30V小电压跑，大约2-3h，溴酚蓝前锋指示剂进入分离胶约5mm时用100V电压，指示剂跑至距玻璃板下沿约5-10mm时停止电泳，电泳完成后用0.5%戊二醛30%乙醇混合液固定凝胶20min。转膜条件：0.22 NC膜，冰浴，200mA，60min。丽春红染色能在MARKER 10KD以下隐约看到条带，发光后片子上背景很深，目的条带隐约可见，颜色特别淡，现在的问题：1.转膜时间，在电泳跑完之后用戊二醛固定20分钟后，对于小分子 9KD，转膜时间大概需要多长，根据考马斯亮蓝染胶时间推测，200mA，1小时10分钟，2小时，胶上仍有小分子蛋白存在（见附件图片），请教老师，老师说戊二醛固定后，按照目前考染的结果看，再延长一个小时也没问题，今天延长转膜时间至2小时30分钟和3小时后，发光结果感觉还不如昨天1小时10分钟跑的。我觉得还是转膜时间问题，请前辈指教一下这种情况下小分子蛋白的转膜时间。 第一次apelin.JPG  转膜1小时10分钟的片子xiu.JPG  转膜2小时后考染胶上仍可见xiu.JPG  转膜2个半小时后考染xiu.JPG |
回复此楼» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有58人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
2楼2013-06-01 04:36:05
3楼2013-06-03 15:47:51
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
4楼2013-06-04 01:25:18