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新虫 (初入文坛)

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专业: 心电活动异常与心律失常

[求助] 小分子（9KD）Trincine 胶且戊二醛固定后的转膜条件

最近在做一种脂肪因子apelin，一抗购自abcam，第一次做的时候撞大运，用20％的SDS-PAGE做出来一个条带（非常不清晰），后来增大一抗浓度，延长或者减少转膜时间（一直为湿转，200mA恒流），但是目的条带再也没出现过，最近改用了TRICINE胶，跑胶后戊二醛固定，转膜条件为：湿转，200mA，1个小时。增大上样量为50ug/孔，低温条件，分离胶之前30V小电压跑，大约2-3h，溴酚蓝前锋指示剂进入分离胶约5mm时用100V电压，指示剂跑至距玻璃板下沿约5-10mm时停止电泳，电泳完成后用0.5%戊二醛30%乙醇混合液固定凝胶20min。转膜条件：0.22 NC膜，冰浴，200mA，60min。丽春红染色能在MARKER 10KD以下隐约看到条带，发光后片子上背景很深，目的条带隐约可见，颜色特别淡，现在的问题：1.转膜时间，在电泳跑完之后用戊二醛固定20分钟后，对于小分子 9KD，转膜时间大概需要多长，根据考马斯亮蓝染胶时间推测，200mA，1小时10分钟，2小时，胶上仍有小分子蛋白存在（见附件图片），请教老师，老师说戊二醛固定后，按照目前考染的结果看，再延长一个小时也没问题，今天延长转膜时间至2小时30分钟和3小时后，发光结果感觉还不如昨天1小时10分钟跑的。我觉得还是转膜时间问题，请前辈指教一下这种情况下小分子蛋白的转膜时间。

第一次apelin.JPG