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86967662

新虫 (初入文坛)

[求助] 小分子（9KD）Trincine 胶且戊二醛固定后的转膜条件

最近在做一种脂肪因子apelin，一抗购自abcam，第一次做的时候撞大运，用20％的SDS-PAGE做出来一个条带（非常不清晰），后来增大一抗浓度，延长或者减少转膜时间（一直为湿转，200mA恒流），但是目的条带再也没出现过，最近改用了TRICINE胶，跑胶后戊二醛固定，转膜条件为：湿转，200mA，1个小时。增大上样量为50ug/孔，低温条件，分离胶之前30V小电压跑，大约2-3h，溴酚蓝前锋指示剂进入分离胶约5mm时用100V电压，指示剂跑至距玻璃板下沿约5-10mm时停止电泳，电泳完成后用0.5%戊二醛30%乙醇混合液固定凝胶20min。转膜条件：0.22 NC膜，冰浴，200mA，60min。丽春红染色能在MARKER 10KD以下隐约看到条带，发光后片子上背景很深，目的条带隐约可见，颜色特别淡，现在的问题：1.转膜时间，在电泳跑完之后用戊二醛固定20分钟后，对于小分子 9KD，转膜时间大概需要多长，根据考马斯亮蓝染胶时间推测，200mA，1小时10分钟，2小时，胶上仍有小分子蛋白存在（见附件图片），请教老师，老师说戊二醛固定后，按照目前考染的结果看，再延长一个小时也没问题，今天延长转膜时间至2小时30分钟和3小时后，发光结果感觉还不如昨天1小时10分钟跑的。我觉得还是转膜时间问题，请前辈指教一下这种情况下小分子蛋白的转膜时间。
小分子（9KD）Trincine 胶且戊二醛固定后的转膜条件
第一次apelin.JPG


小分子（9KD）Trincine 胶且戊二醛固定后的转膜条件-1
转膜1小时10分钟的片子xiu.JPG


小分子（9KD）Trincine 胶且戊二醛固定后的转膜条件-2
转膜2小时后考染胶上仍可见xiu.JPG


小分子（9KD）Trincine 胶且戊二醛固定后的转膜条件-3
转膜2个半小时后考染xiu.JPG
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1楼 2013-05-31 19:54:50
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 86967662 at 2013-06-03 15:47:51
请问您的电泳和转膜条件是怎么样的，求详细 protocol，做实验太虐心了。...

我做tricine一直是跑大胶的，所以电泳稳流跑过夜的。转膜时湿转300mA稳流1-1.5小时，在4°C层析柜里转的。0.22的膜应该没问题。
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4楼2013-06-04 01:25:18
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-06-01 10:48:36
我跑完胶就直接转膜了，不明白为什么要戊二醛固定？
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2楼2013-06-01 04:36:05
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86967662

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-01 04:36:05
我跑完胶就直接转膜了，不明白为什么要戊二醛固定？

请问您的电泳和转膜条件是怎么样的，求详细 protocol，做实验太虐心了。
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3楼2013-06-03 15:47:51
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