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applexixixi

木虫 (小有名气)

[交流] 想扩增10kb多的基因簇，现在有什么技术可以一次性扩增出来吗

10kb多的基因簇是连续的，想扩增出来，在此问问虫友们现在有什么技术可以解决这个问题呢？
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1楼 2012-10-24 16:40:25
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)
★
applexixixi(金币+1): 谢谢参与
你这够呛吧……分两三段用高保真酶PCR出来再连接呗
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2楼2012-10-24 19:17:23
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polepolar

银虫 (初入文坛)
★
applexixixi(金币+1): 谢谢参与
可以试一下Phusion聚合酶,据说可以一次扩增10k多.
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3楼2012-10-24 21:43:12
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wuyun123

禁虫 (著名写手)
★
applexixixi(金币+1): 谢谢参与
本帖内容被屏蔽
8楼2012-10-24 21:55:46
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zhwenxing

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
applexixixi(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-27 13:46:00
1、很多长片段扩增酶类具有能力达到10kb，但模板需要相当“平滑”
2、先用软件分析一下看看有没有容易形成二级结构的区域，GC比较集中的“岛”
3、设计引物也非常关键，pcr的条件需要摸索
4、尝试一下吧，你扩增出来，就会有一大片粉丝啦！
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13楼2012-10-24 22:53:19
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aloon111

金虫 (正式写手)
★
applexixixi(金币+1): 谢谢参与
分段
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14楼2012-10-24 23:07:47
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jl860822

金虫 (正式写手)
★
applexixixi(金币+1): 谢谢参与
应该可以的，但是扩出来也不好测呀
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15楼2012-10-25 08:40:25
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
★
applexixixi(金币+1): 谢谢参与
用过罗氏的高保真taq扩过7-8kb的。
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16楼2012-10-25 10:28:49
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
applexixixi(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-27 13:46:20
感觉一次扩出来可能性有，但是这么长的片段，扩增过程出现突变的几率已经很大了，测序验证又比较麻烦，不验证肯定是不放心。这是个纠结的矛盾。
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17楼2012-10-25 10:58:42
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huiee

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
applexixixi(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-27 13:46:40
推荐一篇paper 如果愿意用的话
Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting

    Jun Fu,       
    Xiaoying Bian,       
    Shengbaio Hu,       
    Hailong Wang,       
    Fan Huang,       
    Philipp M Seibert,       
    Alberto Plaza,       
    Liqiu Xia,       
    Rolf Müller,       
    A Francis Stewart       
    & Youming Zhang       

    Affiliations
    Contributions
    Corresponding authors

    Nature Biotechnology
    30,
    440–446
    (2012)
    doi:10.1038/nbt.2183

Received
    24 October 2011
Accepted
    16 March 2012
Published online
    29 April 2012

Functional analysis of genome sequences requires methods for cloning DNA of interest. However, existing methods, such as library cloning and screening, are too demanding or inefficient for high-throughput application to the wealth of genomic data being delivered by massively parallel sequencing. Here we describe direct DNA cloning based on the discovery that the full-length Rac prophage protein RecE and its partner RecT mediate highly efficient linear-linear homologous recombination mechanistically distinct from conventional recombineering mediated by Redαβ from lambda phage or truncated versions of RecET. We directly cloned all ten megasynthetase gene clusters (each 10–52 kb in length) from Photorhabdus luminescens into expression vectors and expressed two of them in a heterologous host to identify the metabolites luminmycin A and luminmide A/B. We also directly cloned cDNAs and exactly defined segments from bacterial artificial chromosomes. Direct cloning with full-length RecE expands the DNA engineering toolbox and will facilitate bioprospecting for natural products.
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18楼2012-10-26 16:51:13
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★
applexixixi(金币+1): 谢谢参与
Takara的primer STAR可以，DNA质量要高些。
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19楼2012-10-26 17:48:02
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494750284

木虫 (小有名气)
★
applexixixi(金币+1): 谢谢参与
个人觉得分别P之后连接，一下p 10kb保真性肯定不如分别P的高
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20楼2012-10-27 19:37:12
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applexixixi

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by polepolar at 2012-10-24 21:43:12
可以试一下Phusion聚合酶,据说可以一次扩增10k多.

谢谢
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21楼2012-10-29 17:45:24
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applexixixi

木虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by wuyun123 at 2012-10-24 21:55:46
takara宝生物的 LA Taq，可以扩展10kb的片段。

谢谢
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22楼2012-10-29 17:45:38
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applexixixi

木虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by zhwenxing at 2012-10-24 22:53:19
1、很多长片段扩增酶类具有能力达到10kb，但模板需要相当“平滑”
2、先用软件分析一下看看有没有容易形成二级结构的区域，GC比较集中的“岛”
3、设计引物也非常关键，pcr的条件需要摸索
4、尝试一下吧，你扩增 ...

谢谢这么多好的建议！
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23楼2012-10-29 17:46:07
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applexixixi

木虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by aloon111 at 2012-10-24 23:07:47
分段

嗯，确实分段的可操作性强
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24楼2012-10-29 17:46:35
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applexixixi

木虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by jl860822 at 2012-10-25 08:40:25
应该可以的，但是扩出来也不好测呀

确实是个问题
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25楼2012-10-29 17:46:47
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applexixixi

木虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2012-10-25 10:28:49
用过罗氏的高保真taq扩过7-8kb的。

哦，谢谢啦
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26楼2012-10-29 17:47:05
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applexixixi

木虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by joan198108 at 2012-10-25 10:58:42
感觉一次扩出来可能性有，但是这么长的片段，扩增过程出现突变的几率已经很大了，测序验证又比较麻烦，不验证肯定是不放心。这是个纠结的矛盾。

嗯，你说的对，谢谢了
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27楼2012-10-29 17:47:23
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applexixixi

木虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by huiee at 2012-10-26 16:51:13
推荐一篇paper 如果愿意用的话
Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting

    Jun Fu,       
    Xiaoying Bian,       
    Shengbaio Hu ...

非常感谢！
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28楼2012-10-29 17:47:39
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applexixixi

木虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by blackrose8089 at 2012-10-26 17:48:02
Takara的primer STAR可以，DNA质量要高些。

谢谢
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29楼2012-10-29 17:47:56
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applexixixi

木虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by 494750284 at 2012-10-27 19:37:12
个人觉得分别P之后连接，一下p 10kb保真性肯定不如分别P的高

嗯，确实是，我们也是这么考虑的
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30楼2012-10-29 17:48:26
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zhoumin1108

铁虫 (小有名气)
★
applexixixi(金币+1): 谢谢参与
Takara的扩增长片段的就可以，可以扩增20多KB，而且保真性还很好。
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31楼2012-11-02 19:41:04
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zhoumin1108

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
Takara的扩增长片段的就可以，可以扩增20多KB，而且保真性还很好。
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32楼2012-11-02 19:41:44
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fengyue_1001

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
扩增10kb没什么问题，LA-Taq可以胜任，主要是模板质量要好，引物退火温度要达到70度左右，再用两步法来扩增。我13kb的都稳定的扩出来过。
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33楼2012-11-02 22:24:30
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xachenxi4楼
2012-10-24 21:50   回复  
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woai8205楼
2012-10-24 21:51   回复  
applexixixi(金币+1): 谢谢参与
失落的豇豆6楼
2012-10-24 21:52   回复  
applexixixi(金币+1): 谢谢参与
neu2347楼
2012-10-24 21:53   回复  
applexixixi(金币+1): 谢谢参与
tangbohejin9楼
2012-10-24 22:07   回复  
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fangxin10楼
2012-10-24 22:09   回复  
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blackdogzmz11楼
2012-10-24 22:10   回复  
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D11402fc12楼
2012-10-24 22:12   回复  
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