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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请问pET30b这个载体在IPTG诱导后有没有可能表达除了目的蛋白以外的其他蛋白？
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shenxing325

铜虫 (小有名气)

[求助] 请问pET30b这个载体在IPTG诱导后有没有可能表达除了目的蛋白以外的其他蛋白？

用pET30b表达一个蛋白，诱导前后有很明显的蛋白表达条带。但是做Western做了三次了，都没有特异性条带，而且蛋白在37度诱导条件下竟然完全在可溶组分里面，所以我很怀疑是不是我的目的蛋白。但是除了118KD的半乳糖苷酶以外，PET系统应该不会表达除了目的蛋白以外的其他蛋白了吧？
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1楼 2012-10-21 18:07:54
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shenxing325: 金币+3, ★有帮助 2012-10-22 09:57:57
没遇到过这种情况。37度诱导可溶也不一定有问题，是否可溶和蛋白有关。
首先确定表达载体做得没问题。诱导的蛋白分子量对不对？能用标签纯化出来吗？此外，你可以做一个空载体诱导前和诱导后的对照，看看有没有非特异诱导。
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2楼2012-10-22 00:31:24
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linxt2005

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shenxing325: 金币+2, ★有帮助 2012-10-22 09:59:33
首先，这种表达情况是正常的。
其次，如果怀疑，可以做一些简单的测试，最重要的就是活性。
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小兵一个
3楼2012-10-22 09:04:06
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-22 00:31:24
没遇到过这种情况。37度诱导可溶也不一定有问题，是否可溶和蛋白有关。
首先确定表达载体做得没问题。诱导的蛋白分子量对不对？能用标签纯化出来吗？此外，你可以做一个空载体诱导前和诱导后的对照，看看有没有非特 ...

这个蛋白是我从一个大蛋白上截短的一段，本来在整个蛋白当中，这一段是强疏水性部分，不知道单独截出来以后会发生什么变化，除了等电点和可溶性，还应该用哪些手段来表征它的性质呢？感谢你一直关注我的帖子
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4楼2012-10-22 09:57:44
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by linxt2005 at 2012-10-22 09:04:06
首先，这种表达情况是正常的。
其次，如果怀疑，可以做一些简单的测试，最重要的就是活性。

我这个不是酶，没有活性，只能先试试看能不能纯化出来了。但是Western都挂不上的话，亲和柱能挂上吗？？
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5楼2012-10-22 09:59:28
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linxt2005

金虫 (小有名气)
可以试一试，但我觉得可能性比较低。
因为 WB 是在变性的条件下开展的，理论目的蛋白处于一种完全伸展的状态，不存在融合标签由于空间结构而被包裹的现象，所以若是WB没有做出来，说明融合标签可能有一些问题，这样子进行亲和层析，目的蛋白能与填料结合的可能性比较低。
当然，有时候WB呈现出阴性结果是由于抗体的原因，或者体系的调试问题，也是可以有例外的。
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小兵一个
6楼2012-10-22 11:34:54
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by linxt2005 at 2012-10-22 11:34:54
可以试一试，但我觉得可能性比较低。
因为 WB 是在变性的条件下开展的，理论目的蛋白处于一种完全伸展的状态，不存在融合标签由于空间结构而被包裹的现象，所以若是WB没有做出来，说明融合标签可能有一些问题，这样 ...

像你说的，WB如果做出结果来了就肯定是有蛋白，但是如果没出来，也不一定就是没有，原因还很多。我打算先试试上柱，看看行不行，要不也不行那就悲剧了。就只能去打谱了
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7楼2012-10-22 12:15:16
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by shenxing325 at 2012-10-22 09:57:44
这个蛋白是我从一个大蛋白上截短的一段，本来在整个蛋白当中，这一段是强疏水性部分，不知道单独截出来以后会发生什么变化，除了等电点和可溶性，还应该用哪些手段来表征它的性质呢？感谢你一直关注我的帖子...

不知道你表达蛋白是疏水部分的目的是什么。首先，如果只表达一部分的话需要确定表达的这部分形成独立结构，因为去掉蛋白的一部分氨基酸可能造成folding错误，降低蛋白的稳定性。你说的疏水部分跨膜吗？顺便问一下，你有没有对比空载体诱导前后的变化？还有，你所说的Western没做出来用的是抗his-tag抗体吗？
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8楼2012-10-22 12:48:20
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-22 12:48:20
不知道你表达蛋白是疏水部分的目的是什么。首先，如果只表达一部分的话需要确定表达的这部分形成独立结构，因为去掉蛋白的一部分氨基酸可能造成folding错误，降低蛋白的稳定性。你说的疏水部分跨膜吗？顺便问一下， ...

我没有做空载体诱导，这就打算做一做，Western用的是His抗。现在截出来的这算是一小段，如果成功了还要表达另外一段。因为整个分子不容易表达，之前表达整条链的，就没表达出来。
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9楼2012-10-22 15:17:00
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once1015

木虫 (正式写手)
一抗是HIS 有可能被折叠后的蛋白包裹起来 所以比较难检查，个人觉得做个CONTROL 不就行了吗？ 实在不行 去割胶打 MS
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10楼2012-10-22 15:50:16
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