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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请问pET30b这个载体在IPTG诱导后有没有可能表达除了目的蛋白以外的其他蛋白？
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shenxing325

铜虫 (小有名气)

[求助] 请问pET30b这个载体在IPTG诱导后有没有可能表达除了目的蛋白以外的其他蛋白？

用pET30b表达一个蛋白，诱导前后有很明显的蛋白表达条带。但是做Western做了三次了，都没有特异性条带，而且蛋白在37度诱导条件下竟然完全在可溶组分里面，所以我很怀疑是不是我的目的蛋白。但是除了118KD的半乳糖苷酶以外，PET系统应该不会表达除了目的蛋白以外的其他蛋白了吧？
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1楼 2012-10-21 18:07:54
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linxt2005

金虫 (小有名气)
可以试一试，但我觉得可能性比较低。
因为 WB 是在变性的条件下开展的，理论目的蛋白处于一种完全伸展的状态，不存在融合标签由于空间结构而被包裹的现象，所以若是WB没有做出来，说明融合标签可能有一些问题，这样子进行亲和层析，目的蛋白能与填料结合的可能性比较低。
当然，有时候WB呈现出阴性结果是由于抗体的原因，或者体系的调试问题，也是可以有例外的。
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小兵一个
6楼2012-10-22 11:34:54
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shenxing325: 金币+3, ★有帮助 2012-10-22 09:57:57
没遇到过这种情况。37度诱导可溶也不一定有问题，是否可溶和蛋白有关。
首先确定表达载体做得没问题。诱导的蛋白分子量对不对？能用标签纯化出来吗？此外，你可以做一个空载体诱导前和诱导后的对照，看看有没有非特异诱导。
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2楼2012-10-22 00:31:24
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linxt2005

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shenxing325: 金币+2, ★有帮助 2012-10-22 09:59:33
首先，这种表达情况是正常的。
其次，如果怀疑，可以做一些简单的测试，最重要的就是活性。
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小兵一个
3楼2012-10-22 09:04:06
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-22 00:31:24
没遇到过这种情况。37度诱导可溶也不一定有问题，是否可溶和蛋白有关。
首先确定表达载体做得没问题。诱导的蛋白分子量对不对？能用标签纯化出来吗？此外，你可以做一个空载体诱导前和诱导后的对照，看看有没有非特 ...

这个蛋白是我从一个大蛋白上截短的一段，本来在整个蛋白当中，这一段是强疏水性部分，不知道单独截出来以后会发生什么变化，除了等电点和可溶性，还应该用哪些手段来表征它的性质呢？感谢你一直关注我的帖子
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4楼2012-10-22 09:57:44
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