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shenxing325

铜虫 (小有名气)

[求助] 请问pET30b这个载体在IPTG诱导后有没有可能表达除了目的蛋白以外的其他蛋白?

用pET30b表达一个蛋白,诱导前后有很明显的蛋白表达条带。但是做Western做了三次了,都没有特异性条带,而且蛋白在37度诱导条件下竟然完全在可溶组分里面,所以我很怀疑是不是我的目的蛋白。但是除了118KD的半乳糖苷酶以外,PET系统应该不会表达除了目的蛋白以外的其他蛋白了吧?
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linxt2005

金虫 (小有名气)

可以试一试,但我觉得可能性比较低。
因为 WB 是在变性的条件下开展的,理论目的蛋白处于一种完全伸展的状态,不存在融合标签由于空间结构而被包裹的现象,所以若是WB没有做出来,说明融合标签可能有一些问题,这样子进行亲和层析,目的蛋白能与填料结合的可能性比较低。
当然,有时候WB呈现出阴性结果是由于抗体的原因,或者体系的调试问题,也是可以有例外的。
小兵一个
6楼2012-10-22 11:34:54
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

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shenxing325: 金币+3, 有帮助 2012-10-22 09:57:57
没遇到过这种情况。37度诱导可溶也不一定有问题,是否可溶和蛋白有关。
首先确定表达载体做得没问题。诱导的蛋白分子量对不对?能用标签纯化出来吗?此外,你可以做一个空载体诱导前和诱导后的对照,看看有没有非特异诱导。
2楼2012-10-22 00:31:24
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linxt2005

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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shenxing325: 金币+2, 有帮助 2012-10-22 09:59:33
首先,这种表达情况是正常的。
其次,如果怀疑,可以做一些简单的测试,最重要的就是活性。
小兵一个
3楼2012-10-22 09:04:06
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shenxing325

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-22 00:31:24
没遇到过这种情况。37度诱导可溶也不一定有问题,是否可溶和蛋白有关。
首先确定表达载体做得没问题。诱导的蛋白分子量对不对?能用标签纯化出来吗?此外,你可以做一个空载体诱导前和诱导后的对照,看看有没有非特 ...

这个蛋白是我从一个大蛋白上截短的一段,本来在整个蛋白当中,这一段是强疏水性部分,不知道单独截出来以后会发生什么变化,除了等电点和可溶性,还应该用哪些手段来表征它的性质呢?感谢你一直关注我的帖子
4楼2012-10-22 09:57:44
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