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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 帮我看看是什么情况
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yananhl

银虫 (小有名气)

[求助] 帮我看看是什么情况

我做的基因步移，我的第二轮PCR条带还很好。第三轮用的LA酶扩的也很好，但是换了酶扩第三轮，以及稀释1000倍后扩的怎么就堵在孔里下不来了，是什么情况啊，请高手看看。
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    • 2012-10-19 21:31:02, 437.7 K

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1楼 2012-10-19 21:28:49
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tulip1213

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
为什么换酶扩？之前扩出来为什么不及时回收？不知道你目的条带是多大？换酶之后，条带扩出来没？扩出来的话，回收；电泳跑不出孔，说明DNA不纯。可能你的PCR体系污染
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2楼2012-10-19 22:22:04
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yananhl

银虫 (小有名气)
因为我扩的片段大，3000多了达到，连接是个问题，老连接不成功。所以换酶扩，连接就正常。但是其它的都正常，就是换了酶然后就跑不出孔了。但是用LA酶扩的时候有一个随机引物第三轮也没有跑出孔，其它的都正常。如果是PCR体系污染了，怎么扩几次都是这种情况呢，用的都是同一批的PCR管。
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3楼2012-10-21 14:14:16
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yananhl

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by tulip1213 at 2012-10-19 22:22:04
为什么换酶扩？之前扩出来为什么不及时回收？不知道你目的条带是多大？换酶之后，条带扩出来没？扩出来的话，回收；电泳跑不出孔，说明DNA不纯。可能你的PCR体系污染

因为我扩的片段大，3000多了达到，连接是个问题，老连接不成功。所以换酶扩，连接就正常。但是其它的都正常，就是换了酶然后就跑不出孔了。但是用LA酶扩的时候有一个随机引物第三轮也没有跑出孔，其它的都正常。如果是PCR体系污染了，怎么扩几次都是这种情况呢，用的都是同一批的PCR管。
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4楼2012-10-21 14:14:32
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tulip1213

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by yananhl at 2012-10-21 14:14:32
因为我扩的片段大，3000多了达到，连接是个问题，老连接不成功。所以换酶扩，连接就正常。但是其它的都正常，就是换了酶然后就跑不出孔了。但是用LA酶扩的时候有一个随机引物第三轮也没有跑出孔，其它的都正常。如 ...

我5000都连成功了,何况3000。你拿有条带的做模板，稀释50或100倍p吧
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5楼2012-10-21 15:52:25
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yananhl

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by tulip1213 at 2012-10-21 15:52:25
我5000都连成功了,何况3000。你拿有条带的做模板，稀释50或100倍p吧...

请问您用的什么载体连接的啊？我用的PMD19，连接老出问题。恩，就是稀释的也是堵在孔那了。用LA扩的还好
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6楼2012-10-21 20:16:30
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