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laqiwe

铁虫 (正式写手)

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[交流] 求PCR实验的推荐

本人最近在学PCR，求推荐此方向的好的资源（主要是书籍）需要的是专门讲解PCR的，内容广泛，而不是在某本书中只是提到注：我只想知道资源的名字并不是向他人索要资源，所以请版主鉴别后不要删

[ Last edited by laqiwe on 2012-9-20 at 12:41 ]

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1楼 2012-09-20 08:20:05

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木小默

铁虫 (小有名气)

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laqiwe(金币+1): 谢谢参与
laqiwe: 回帖置顶 2012-10-05 18:04:06
laqiwe: 金币+4 2012-10-05 18:04:14

实验七  聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA
目的
1、学习PCR反应的基本原理和实验技术。
2、了解引物设计的一般要求。
原理
聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术。利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片段，以用于基因工程操作。
PCR进行的基本条件：
⑴DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）；
⑵引物；
⑶dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）
⑷Taq DNA聚合酶
PCR循环由三个步骤组成：
⑴变性使模板DNA解离成单链；
⑵退火使引物与模板DNA所需扩增序列结合；
⑶延伸 DNA聚合酶利用dNTP合成与模板碱基序列互补的DNA链。
每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
引物设计：要保证PCR反应能准确，特异，有效的对引物DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下原则：
⑴引物长度：15~25个核苷酸；
⑵CG含量为40%~60%；
⑶Tm值为55℃（Tm=4（C+G）+2（A+T）计算；
⑷引物与非特异配对位点的配对率小于70%；
⑸引物自身配对形成的茎环结构，茎的碱基对小于3，
⑹两条引物间配对碱基数小于5个。
由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设计。
本实验以实验一中提取的质粒DNA为模板，进行PCR扩增，大量得到目的DNA片段。
试剂与器材
一、试剂
1、 Taq DNA聚合酶
2、 10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2）
3、 dNTP
4、引物（P1、P2）
5、溴乙啶染色液(EB)： 10mg/ml溴乙啶。注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。
6、点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。
二、器材
1、 PCR扩增仪
2、电泳仪
3、台式离心机
4、紫外分析仪
5、恒温水浴
6、凝胶成像系统
操作步骤
一、 PCR扩增
1、按下表加入试剂，并小心混匀。模板为实验一中提取的质粒DNA。
试剂体积（ 50ul）
ddH2O 35ul
10 x buffer 5ul
10×dNTP 5ul
Primer P1 1ul
Primer P2 1ul
模板 2ul
Taq 酶（2.5U）    1.0ul
2、设置PCR程序：

            94 ℃       180s
            94 ℃       45s
35 cycles: 55℃       45s
            72 ℃       60s
            72 ℃       600s
3、运行PCR程序

二、 PCR产物鉴定
反应结束后，取20ul PCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。
这个也是下载的供参考