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[交流]
求PCR实验的推荐
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本人最近在学PCR，求推荐此方向的好的资源（主要是书籍） 需要的是专门讲解PCR的，内容广泛，而不是在某本书中只是提到 注：我只想知道资源的名字并不是向他人索要资源，所以请版主鉴别后不要删 [ Last edited by laqiwe on 2012-9-20 at 12:41 ] |
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实验七 聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 目的 1、学习PCR反应的基本原理和实验技术。 2、了解引物设计的一般要求。 原理 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术。利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片段，以用于基因工程操作。 PCR进行的基本条件： ⑴DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）； ⑵引物； ⑶dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ⑷Taq DNA聚合酶 PCR循环由三个步骤组成： ⑴变性 使模板DNA解离成单链； ⑵退火 使引物与模板DNA所需扩增序列结合； ⑶延伸 DNA聚合酶利用dNTP合成与模板碱基序列互补的DNA链。 每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。 引物设计：要保证PCR反应能准确，特异，有效的对引物DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下原则： ⑴引物长度：15~25个核苷酸； ⑵CG含量为40%~60%； ⑶Tm值为55℃（Tm=4（C+G）+2（A+T）计算； ⑷引物与非特异配对位点的配对率小于70%； ⑸引物自身配对形成的茎环结构，茎的碱基对小于3， ⑹两条引物间配对碱基数小于5个。 由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设计。 本实验以实验一中提取的质粒DNA为模板，进行PCR扩增，大量得到目的DNA片段。 试剂与器材 一、 试剂 1、 Taq DNA聚合酶 2、 10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2） 3、 dNTP 4、 引物（P1、P2） 5、 溴乙啶染色液(EB)： 10mg/ml溴乙啶。 注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。 6、 点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。 二、 器材 1、 PCR扩增仪 2、 电泳仪 3、 台式离心机 4、 紫外分析仪 5、 恒温水浴 6、 凝胶成像系统 操作步骤 一、 PCR扩增 1、按下表加入试剂，并小心混匀。模板为实验一中提取的质粒DNA。 试剂 体积（ 50ul） ddH2O 35ul 10 x buffer 5ul 10×dNTP 5ul Primer P1 1ul Primer P2 1ul 模板 2ul Taq 酶（2.5U） 1.0ul 2、设置PCR程序： 94 ℃ 180s 94 ℃ 45s 35 cycles: 55℃ 45s 72 ℃ 60s 72 ℃ 600s 3、运行PCR程序 二、 PCR产物鉴定 反应结束后，取20ul PCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。 这个也是下载的 供参考 |
6楼2012-10-04 22:40:25
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2012-10-05 07:39
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