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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大家好，在RT的时候，如果加入RNA的量远远超过了试剂盒所规定的，会有什么影响？
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

[求助] 大家好，在RT的时候，如果加入RNA的量远远超过了试剂盒所规定的，会有什么影响？

试剂盒中要求的最大合成量是1ug，我前几天加过了4.5ug，结果跑胶的时候出来假阳性，而且只有假阳性，目的条带都没有，RNA质量检测OD比值为2.1，这种情况下是不是由于RNA的量太多，杂合链中的RNA还是没有除去，杂合链影响了PCR的扩增影响呢？？？？？请解释一下
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1楼 2012-09-17 09:01:52
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cxfans

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这倒不至于把 RNA纯度不好会影响
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2楼2012-09-17 10:30:58
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人觉得还是你的ＲＮＡ质量不是太好，OD比值2.1是OD260/280还是OD260/230呢？
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持之以恒、永不放弃！
3楼2012-09-17 16:31:02
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-09-17 16:31:02
个人觉得还是你的ＲＮＡ质量不是太好，OD比值2.1是OD260/280还是OD260/230呢？

OD260/280的比值是2.1   OD260/230的是1.8，我现在感觉只要OD260/280的比值超过了2.0，就很难出来好的结果啊！就是他两的比值是1.6也比比值是2.1的要好啊！
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4楼2012-09-17 16:34:14
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cxfans at 2012-09-17 10:30:58
这倒不至于把 RNA纯度不好会影响

恩，我觉得还是完整性出现了问题了吧  我想请教您一下，您做rt的时候，是RNA出来之后直接做RT呢，还是先要测定其浓度和电泳检测其完整性后再进行RT？我是这样想的，为了RNA完整性，我直接先不测RNA浓度，先做RT，然后RT再做上的时候，再测定其浓度和完整性。
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5楼2012-09-17 16:37:48
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weishu杯子

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by czcpudai at 2012-09-17 16:37:48
恩，我觉得还是完整性出现了问题了吧  我想请教您一下，您做rt的时候，是RNA出来之后直接做RT呢，还是先要测定其浓度和电泳检测其完整性后再进行RT？我是这样想的，为了RNA完整性，我直接先不测RNA浓度，先做RT，然 ...

最好先确定下其浓度和完整性，这样能保证RT的成功。
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快乐源于生活!!
6楼2012-09-17 16:59:06
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by weishu杯子 at 2012-09-17 16:59:06
最好先确定下其浓度和完整性，这样能保证RT的成功。...

确定浓度和RNA需要一定的时间，这样子其余的RNA 就要冻存吧？可是解冻后会不会质量不如刚提取出来的好呢？当然冻存是在-80超低温冰箱中
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7楼2012-09-18 13:00:30
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fhj20050708

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-19 15:04:39
可能还是楼主的rna质量不太好吧，我上次消化DNA后浓度是7100ug/ml,260/280=1.97,260/230=2.2,反转录时加入的总rna=3.55ug，另一管总rna=2.13ug（TAKARA的反转录酶），反转录时rna多加得到的cdna进行pcr后目的基因条带的亮度要高于后者pcr产物。
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8楼2012-09-19 08:39:53
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cxfans

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by czcpudai at 2012-09-17 16:37:48
恩，我觉得还是完整性出现了问题了吧  我想请教您一下，您做rt的时候，是RNA出来之后直接做RT呢，还是先要测定其浓度和电泳检测其完整性后再进行RT？我是这样想的，为了RNA完整性，我直接先不测RNA浓度，先做RT，然 ...

别扯了 完整性的问题 测个浓度 跑个胶洁能看出来 260/230若是低于1.5 就不会有RT的结果，我刚试的
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9楼2012-09-19 09:56:29
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by fhj20050708 at 2012-09-19 08:39:53
可能还是楼主的rna质量不太好吧，我上次消化DNA后浓度是7100ug/ml,260/280=1.97,260/230=2.2,反转录时加入的总rna=3.55ug，另一管总rna=2.13ug（TAKARA的反转录酶），反转录时rna多加得到的cdna进行pcr后目的基因条 ...

恩 我试剂盒上面写的是10ng-1ug的量 反转录酶是200U 的量  质量不太好吧
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10楼2012-09-19 10:58:11
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