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wuxiaoyan06金虫 (小有名气)
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[求助]
请问如何设计兼并引物
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| 本人最近在学习怎么设计兼并引物，通过比对20种该基因的氨基酸序列找到了它的保守区域，用primer5设计引物简并度太高不知道怎么取舍，不知道用什么软件设计兼并引物好，各位可不可以给些见意和方法啊，谢谢了！ |
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水牛默默
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
wuxiaoyan06: 金币+5, 博学EPI+1, ★★★很有帮助 2012-10-06 17:13:56
wuxiaoyan06: 金币+5, 博学EPI+1, ★★★很有帮助 2012-10-06 17:13:56
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理论上说：由氨基酸回导核酸序列，同时考虑到细菌使用密码子的偏爱性，以减少兼并度，但是这样得到的兼并引物的兼并密码子比较多，我建议你可以先从网上找到已经报道的比较近的几种菌的序列，然后比对，设计兼并引物，这样做没问题，我觉得还比较简便，因为我就是这么做的，也没用primer软件啊！ 另外3端最好不是兼并密码子，你可以在网上查查看。 下面是网上找到的详细的简并引物设计原则和Primer5.0 设计简并引物的方法可以参考下： 简并引物设计原则： 1． 选择高度保守的序列作为引物。如果可能的话，选择在基因家族内和不同种属间都保守的序列。 2． 选择兼并度最小的序列 a. 含有色氨酸和甲硫氨酸的肽段为首选，因为其密码子是唯一的 b. 尽可能不用含有亮氨酸、精氨酸、丝氨酸的肽段。 3． 若引物序列高度简并，利用脊椎动物基因组中CpG二核苷酸的较低丰度，可望降低兼并度。并结合密码子优先表，或在有兼并度的地方引入次黄苷来降低兼并度。 4． 引物的3‘端残基尽可能使用确定残基。但令人吃惊的是，当G、C或T发生错配时，3’端的T残基相对保持中立。 5． PCR产物的合适长度为200～1000bp。 6． 如果蛋白中有两个以上的区域高度保守，可构建几套PCR引物，以便使用“巢式”PCR来增加特异性。 PCR反应条件 1． 退火温度 总的来说，退火温度越低，非特异性扩增的可能性越大。低至37度的退火温度也可被采用于高度简并的引物进行PCR扩增。Touchdown PCR也可以减少错误扩增 2． 扩增的循环数 过多循环数导致非特异性带的产生；可以每5个循环取一定样品来检测扩增的特异性 3． 降温时间 不同的PCR仪效率不同。较长的降温时间有利于错配杂交的产生 4． PCR缓冲液成分 主要在于Mg＋＋离子的浓度。 Primer5.0 设计简并引物的方法： 首先把各个CDs序列分别存储为fasta格式，然后在 file-open-DNA sequence 里边把各个序列依次加入，然后点击align，比对完之后再点击primer，调整参数进行search或手工拉动选择引物。表现的形式是非简并性的，但是你从下边可以看得出来哪个碱基是非简并性的，再手工调整。其他原则同一般的简并引物设计原则，如3‘避免简并性等等。 还可以在线用codehop设计，如果需要这种方法，我可以告诉你怎么搞。 |
2楼2012-10-02 21:13:30
