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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 我的PCR结果让我郁闷了啊，有图有真像……
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linxi185856

新虫 (初入文坛)

[求助] 我的PCR结果让我郁闷了啊，有图有真像……

图中是用RNA反转录后的cDNA为模板进行的PCR，我的目的条带在740bp，引物设计的时候，是没有引物二聚体的，退火温度是在低于TM值4度，变性45s，延伸45s；30个循环。可是出来的确实这样的情况，请各位大侠帮助分析下，到底是什么情况？

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1楼 2012-09-06 19:46:09
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-09-07 13:46:01
1楼的建议很好，稀释模板，用巢式PCR方法都可以有效增加目的产物，另外引物设计并非只是避免引物二聚体就可以了，因为RT后CDNA比较复杂，模板并不单一，因而引物要求要比以质粒为模板时的PCR要高，尽量要避免错配等情况发生，另外引物设计自由能也要从5‘-3’端整体趋势降低，这样有利于引物退火。建议做梯度PCR摸索最佳退火温度，如果一轮不行用巢式PCR扩增，还有就是好好分析一下引物，提高引物的质量。
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3楼2012-09-07 10:11:42
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普通回帖

merryyiyi

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+5, 鼓励应助 2012-09-07 13:45:40
linxi185856: 金币+1, ★★★★★最佳答案, 谢谢，我再改变引物等条件尝试下 2012-09-12 21:20:16
产生大分子量的弥散条带，大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的。
建议：可将将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10（或1:100-1:200）；另外，
在PCR扩增阶段，尽可能提高扩增用的模板的纯度，适当提高退火温度或使用touchdown（二阶段温度法）的方法重新扩增；或者设计内外两对引物，采用半巢式或者巢式PCR的扩增方法，以提高产物的特异性。
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2楼2012-09-07 09:41:00
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linxi185856

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by huguangdong at 2012-09-07 10:11:42
1楼的建议很好，稀释模板，用巢式PCR方法都可以有效增加目的产物，另外引物设计并非只是避免引物二聚体就可以了，因为RT后CDNA比较复杂，模板并不单一，因而引物要求要比以质粒为模板时的PCR要高，尽量要避免错配等 ...

你好，这些条带都是在我的目的条带下面，目的大小在740，这些条带在500一下，又是模糊一片，是非特异性条带吗？我用的是Taq酶，延伸45s应该是够了，
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4楼2012-09-08 17:06:12
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by linxi185856 at 2012-09-08 17:06:12
你好，这些条带都是在我的目的条带下面，目的大小在740，这些条带在500一下，又是模糊一片，是非特异性条带吗？我用的是Taq酶，延伸45s应该是够了，...

看图你这根本不算是条带，弥散性的表示你的引物不好，而且也混杂着引物二聚体，所以最好重新设计引物即可，没说你的延伸时间不够，只是让你修改引物。
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5楼2012-09-08 19:06:27
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小小技术官

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-09-10 13:47:38
我上学期做的PCR结果与你的结果 大同小异，我设过温度梯度，稀释过模版浓度，都没效果。我觉得应该是引物设计的不太理想。。
看你的结果，既然目的序列偏小，可能是引物与非目的序列的cDNA结合了，建议你将设计的引物在genebank里blast一下看看吧
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生活是一面镜子，要笑着面对！
6楼2012-09-08 19:08:36
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linxi185856

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by huguangdong at 2012-09-08 19:06:27
看图你这根本不算是条带，弥散性的表示你的引物不好，而且也混杂着引物二聚体，所以最好重新设计引物即可，没说你的延伸时间不够，只是让你修改引物。...

我设计引物的详细信息在附图里，虽然显示有一点错配，但是是在序列的最后面，不能算是错配，其他的引物自身的交叉，貌似也不影响，我刚试过稀释模板、升高一系列退火温度等都没有出现目的条带，应该是最初的cDNA的问题。多谢各位的帮助。

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7楼2012-09-09 12:35:19
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-10 13:47:59
引用回帖:
7楼: Originally posted by linxi185856 at 2012-09-09 12:35:19
我设计引物的详细信息在附图里，虽然显示有一点错配，但是是在序列的最后面，不能算是错配，其他的引物自身的交叉，貌似也不影响，我刚试过稀释模板、升高一系列退火温度等都没有出现目的条带，应该是最初的cDNA的 ...

你这个引物怪不得会扩增不出来，两条引物TM值相差太大， 而且上游引物的TM值都已经超过了72度，不但不好退火，而且还会影响后面的延伸，这种引物首先看TM值就可以排除了，但不知你上游引物是不是引入酶切位点，如果这样就另当别论。
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8楼2012-09-09 18:25:21
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think-edge

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

看看这些帖子 学到不少东西啊  谢谢各位  这个很可能是引物的问题
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9楼2012-09-10 09:11:26
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hch123

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我觉得你那胶有问题，你的Maker都跑成那样，如果你的产物浓度不大，杂带有很多的话，会出现这样的状况。所以建议你先重跑下再考虑引物问题。
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脚踏实地：遇一个，学一个，会一个。。。
10楼2012-09-10 10:36:46
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