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linxi185856

新虫 (初入文坛)

[求助] 我的PCR结果让我郁闷了啊，有图有真像……

图中是用RNA反转录后的cDNA为模板进行的PCR，我的目的条带在740bp，引物设计的时候，是没有引物二聚体的，退火温度是在低于TM值4度，变性45s，延伸45s；30个循环。可是出来的确实这样的情况，请各位大侠帮助分析下，到底是什么情况？

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1楼 2012-09-06 19:46:09
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小小技术官

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-09-10 13:47:38
我上学期做的PCR结果与你的结果 大同小异，我设过温度梯度，稀释过模版浓度，都没效果。我觉得应该是引物设计的不太理想。。
看你的结果，既然目的序列偏小，可能是引物与非目的序列的cDNA结合了，建议你将设计的引物在genebank里blast一下看看吧
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生活是一面镜子，要笑着面对！
6楼2012-09-08 19:08:36
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merryyiyi

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+5, 鼓励应助 2012-09-07 13:45:40
linxi185856: 金币+1, ★★★★★最佳答案, 谢谢，我再改变引物等条件尝试下 2012-09-12 21:20:16
产生大分子量的弥散条带，大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的。
建议：可将将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10（或1:100-1:200）；另外，
在PCR扩增阶段，尽可能提高扩增用的模板的纯度，适当提高退火温度或使用touchdown（二阶段温度法）的方法重新扩增；或者设计内外两对引物，采用半巢式或者巢式PCR的扩增方法，以提高产物的特异性。
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2楼2012-09-07 09:41:00
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-09-07 13:46:01
1楼的建议很好，稀释模板，用巢式PCR方法都可以有效增加目的产物，另外引物设计并非只是避免引物二聚体就可以了，因为RT后CDNA比较复杂，模板并不单一，因而引物要求要比以质粒为模板时的PCR要高，尽量要避免错配等情况发生，另外引物设计自由能也要从5‘-3’端整体趋势降低，这样有利于引物退火。建议做梯度PCR摸索最佳退火温度，如果一轮不行用巢式PCR扩增，还有就是好好分析一下引物，提高引物的质量。
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3楼2012-09-07 10:11:42
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linxi185856

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by huguangdong at 2012-09-07 10:11:42
1楼的建议很好，稀释模板，用巢式PCR方法都可以有效增加目的产物，另外引物设计并非只是避免引物二聚体就可以了，因为RT后CDNA比较复杂，模板并不单一，因而引物要求要比以质粒为模板时的PCR要高，尽量要避免错配等 ...

你好，这些条带都是在我的目的条带下面，目的大小在740，这些条带在500一下，又是模糊一片，是非特异性条带吗？我用的是Taq酶，延伸45s应该是够了，
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4楼2012-09-08 17:06:12
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