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植物原生质体
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我最近在提取原生质体，我做的是小麦的，我试了2个方案 方案一： 试剂： (1)酶液 1％纤维素酶 1％果胶酶 0.7mol/L（12.7519g溶于100mL）甘露醇 0.7mmol/L(0.00952g溶于100mL)KH2PO4 10mmol/L(0.14698g溶于100mL)CaCl2•2H2O pH6.8—7.0 (2)13％CPW洗液 27．2 mg／L KH2PO4 101.0 mg／L KNO3 1480．0 mg／L CaCl2•2H2O 246．0 mg／L MgSO4 0．16 mg／L KI 0．025 mg／L CuSO4 13％ W／V甘露醇 pH 6.0 (3)20％蔗糖溶液 步骤： 取无菌叶，切成薄片后，置于酶液中和摇床上（60～70rpm），在25～28℃黑暗条件下，酶解5～7h。 用200目网过滤除去未完全消化的残渣。在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清。 加入3～ 4ml l3％CPW洗液，相同条件下离心2-5分钟，弃上清，留1ml洗液。 用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸也，轻轻铺于20％蔗糖溶液上(5ml离心管装3m120％蔗糖溶液)，在1000rpm条件下离心5—10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20％的蔗糖与13％ CPW之间，破碎的细胞残渣沉入管底。 用200μl移液器轻轻将状态好的原生质体吸出(注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液)，放入另一干净的离心管中．加4ml l3％CPW洗液，1000rpm离心2-5分钟，弃上清． 用血球计数板调整原生质体密度为105一106/ml之间。 方案二： 试剂： (1)酶:洗液+1.5%纤维素酶Onozyka RS+0.3%果胶酶Y-23，调PH为5.7-5.8然后以0.22μm微孔滤膜抽滤灭菌; 洗液:10.92g甘露醇+55.sgCaC12+looml水，pH5.7-5.8，高压蒸汽灭菌 步骤： ①取叶片剁碎以后，分别经含有纤维素酶(1%w/v)和果胶酶 (0.3%w/v)的混合酶液处理3-4h，新游离出的原生质体圆、透明、内含物较多; ②用置于9cm培养皿中，经300μm不锈钢网过滤酶解产物，过滤下的原生质体和酶混合液转入5ml离心管中，用洗液冲洗滤网两次，将液体转入另一离心管中 ③500rpm离心5min，收集原生质体，小心吸出上清(酶液)，回收备用，不要触动原生质体 ④加入PBS缓冲液至离心管中，用吸管将沉淀全部吹起，形成均匀悬液，500rpm离心5min，小心吸出上清(PBS缓冲液)，收集原生质体 ⑤重复步骤④2-3次，以去掉残留的酶液 ⑥离心管中加入PBS缓冲液，制成浓度105个/ml的均匀悬液 问题：1.酶液怎么配比较好呢？看这两个方案中配的不大一致，哪个好？酶的用量多少合适？酶解的时间多久合适？还有洗液要求高吗?两个方案也差好多，而且第一个方案的洗液配起来超麻烦。 2.下面这个问题比较困惑，就是方案一需要20%蔗糖，方案二不需要,蔗糖说是用来提取活力高的原生质体，但是我用方案一的时候，分层不大明显，我把上面的说是带有高活性原生质体的液体洗出来时感觉跟吸水差不多，然后就把最底层的离心出来的沉淀扔了（按方案一的说法这些沉淀都是死细胞或者破碎细胞），第二个方案我却直接用的离心完的沉淀，也就是说我取的都是死细胞？但是人家用方案二的人却做出来了呀。 3.离心时这个转速的问题。。。500、1000rpm,感觉有点小啊，有时离心完感觉沉淀还不明显呢，稍微一动就浑浊了。。。 以上就是我的众多疑问。。。有点多。。。没办法。。。断断续续的做了好几个月了眼看马上就要开始做试验了还做不出来，我没人可问，实验室师哥师姐都是做鱼做蚯蚓的。。。。我第一个做植物的问他们也不明白。。。还是来这里问问，希望有经验的懂点的都来说两句，会哪个问题就说哪个就行，谢谢啊！！ |
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1 文献不可不信不可尽信，尤其是中文文献。具体应该用什么样的酶液，这需要你自己摸索。植物材料状态，你的操作，试剂等等影响很大，楼主不妨把两种酶液都试试，寻找效果最好的组合。 2 第一种方法重点在于梯度离心分离状态最好的原生质体，第二种则希望尽可能收集所有细胞，各有利弊。如果你酶解后细胞情况较好，可以考虑第一种方法，如果大量细胞在酶解后破碎死亡，用第二种。 3 原生质体非常脆弱，一点点机械损伤就可能杀死它们，500-1000 rpm很正常，要避免再悬浮，操作小心一点。 楼上虫友的回答有一点答非所问，但谈到的确实是几个做原生质体的要点，非常值得参考 |
3楼2012-08-27 01:58:00
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