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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 材料区 » 生物材料 » 生物效应评价 » [真诚求助] 免疫荧光染内皮细胞的Vinculin方法 (Focal Adhesion component)
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dingyonghui

铜虫 (小有名气)

[求助] [真诚求助] 免疫荧光染内皮细胞的Vinculin方法 (Focal Adhesion component)

RT, 本人初次做细胞实验，Ti经过改性的sample，进行内皮细胞培养后，想通过染色看细胞在样品表面粘附的情况，染Vinculin看Focal Adhesion 的分布，买了一抗是Anti-Vinculin antibody (Mouse monoclonal); 二抗是Goat polyclonal Secondary Antibody to Mouse IgG-H&L(FITC); 问题如下：
（1）染Vinculin用不用Triton X-100 破膜？判断标准是什么？
（2）一抗和二抗分别用什么来稀释啊？网上查了很多，有说用blocking solution （1%BSA/PBS），有的说直接PBS，有的说一抗和二抗不一样, 非常的困惑，恳求高手指点啊！！！
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Biomaterials
1楼 2012-08-10 00:15:38
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liubin

专家顾问 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
markar: 金币+1, 感谢回帖交流！ 2012-08-13 12:46:24
对照试剂盒，一步一步的做就可以了。
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2楼2012-08-12 16:42:53
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dingyonghui

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by liubin at 2012-08-12 16:42:53
对照试剂盒，一步一步的做就可以了。

谢谢回复！关键的问题就是试剂盒并没有给出具体详细的信息，只给出了推荐的working concentration range以及染色时间，并未说明用什么来dilute 一抗和二抗~~ 继续求助啊！
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Biomaterials
3楼2012-08-12 17:04:18
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liubin

专家顾问 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
markar: 金币+1, 感谢回帖交流 2012-08-13 12:46:33
亲，你去做个SEM 吧。
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4楼2012-08-12 17:08:52
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liubin

专家顾问 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
markar: 金币+1, 感谢回帖交流 2012-08-13 12:46:42
这就是 VEC 在材料上粘附的SEM 图片
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5楼2012-08-12 17:19:40
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dingyonghui

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by liubin at 2012-08-12 17:08:52
亲，你去做个SEM 吧。

老大 这完全不一码事好不好 SEM能看到分辨出Focal Adhesion么
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Biomaterials
6楼2012-08-12 18:21:52
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liubin

专家顾问 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
mwyuer: 金币+2, 专家考核, 感谢回帖交流 2012-08-12 20:24:10
这个，看粘附斑，我确实有点不懂。
不破碎细胞吧，应该看不见粘附斑
破碎细胞吧，你如何保障你所检测的蛋白分子还在材料上而没有被洗脱掉？
可能还不仅是破膜的问题，
这个实验偶没有做过。
不过一抗与蛋白分子的接合是关键。
你这个试剂盒偶没有用过，按所提供的范围，你按最大剂量加吧。
顺便问一下？啥玩意儿试剂盒哦，使用方法咋这么不详细？
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7楼2012-08-12 18:55:13
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jialong-dt

金虫 (正式写手)

突破者

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
mwyuer: 金币+1, 感谢回帖交流 2012-08-13 08:16:26
细胞膜蛋白染色：破坏细胞膜与否对结果影响不大，若要破坏，时间短些效果好点，切记时间勿超过10min；
抗体稀释：一般一抗使用1%的BSA封闭液比较合适；二抗PBS或者封闭液都可以使用。
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不停的学习，只因为原来荒废了太多时间
8楼2012-08-12 20:55:03
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dingyonghui

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jialong-dt at 2012-08-12 20:55:03
细胞膜蛋白染色：破坏细胞膜与否对结果影响不大，若要破坏，时间短些效果好点，切记时间勿超过10min；
抗体稀释：一般一抗使用1%的BSA封闭液比较合适；二抗PBS或者封闭液都可以使用。

多谢 我已搞定 实际操作和你说的一样
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Biomaterials
9楼2012-08-24 20:07:52
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