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未央mercedes

新虫 (初入文坛)

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[交流] cDNA链的连接、包装及转染

实验概要

本实验介绍了构建cDNA文库中的cDNA链的连接、包装及转染流程。

主要试剂

EcoRⅠ连接子试剂盒

主要设备

恒温水浴，离心机、电泳仪、电泳槽、紫外观测仪

实验步骤

1. cDNA加接头反应

1) 按下表准备反应体系

               10×缓冲液T4DNA连接酶  3μl

               BSA                   3μl

               cDNA                   2.5μl

            连接子                1μl

            T4DNA连接酶             1μl

            加水至                30μl

2) 15℃保温6-18小时。

3) 70℃加热10分钟后放置于冰浴。

2. 磷酸化反应

1) 按下表准备反应体系

         上述1.a反应物       30μl

         T4磷酸激酶10×缓冲液 4μl

         0.1mM ATP             2μl

         T4激酶(10μ/μl)    1μl

         水                   3μl

         总体积             40μl

2) 37℃保温30分钟。用DNA纯化柱纯化带接头的cDNA。

3) 用1ml Sephacryl S-400装柱，TEN缓冲液平衡拄，平衡液流干后，加套管，800g5min。

4) 上样，用1mlTEN缓冲液洗柱2次，收集洗脱液。洗脱时加套管，800g5min。

5) 合并洗脱液。

6) 3M NaAC和无水乙醇沉淀，干燥复溶。

3. cDNA与载体联接：

1) 准备4个离心管，按下表加入

                                                         A B C D

         载体DNA0.5ug/ul)                      2

         cDNA(10ng/ul)                   0 3  2 1

         10×T4DNA连接酶缓冲液          1

         水                                           6 3 4 5

         T4DNA连接酶                               1

2) 保温，室温:3小时;4℃过夜。

4. 体外包装：

1) 从－70℃取出包装蛋白，冰浴中溶化，每管50ul。

2) 包装蛋白混合液完全溶化后，立即加入10ul“3.a”中的连接液，轻弹管壁，轻轻混匀。

3) 22℃（室温）放置3小时。

4) 上述包装混合液中加入445ul的phage缓冲液和25ul氯仿，轻轻混匀，冰浴保存。（包装液4℃下可存放7天）。

5. 感染

1) 灭菌培养皿中倒入下层LB培养基，凝固后，37℃保温。

2) 安1：1000的比例稀释“4”中的包装混合液。

3) 取100ul稀释液和100ul菌株（Y1090、LE392）。

4) 取4ml熔化45℃保温的上层培养基加入到“c”中的混合液中，混匀后铺板在37℃预热的下层培养基上，37℃过夜。

6. 收集和扩增文库

构建的cDNA文库经扩增后，才能保存和进行长期筛选。本文库由λgt11作为载体而构成，因此扩增时应在大肠杆菌Y1090中进行。

1) 过夜后的皿上挑取出现的噬菌斑，加2－3mlSM缓冲液，室温震荡２小时。４℃7000g离心30min，以除去细胞碎片，分装上清，溶解噬菌斑，4℃8000－10000g快速离心10min，以除去细胞碎片和培养基成分。

2) 重复上步操作。

3) 上清液转入一新管中，如要在4℃短期保存则按１ml上清中加入20-30μl的比例加入氯仿，4℃保存；如要长期保存则应加入终浓度为７％的二甲基亚砜，于－70℃保存。以被需要时重新涂板筛选文库。

来自E V E R L A B 云端实验室

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