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肖颖2009

铁虫 (正式写手)

[交流] 关于小片段连载体的问题 已有6人参与

大家来谈谈“小片段连载体一般会遇到什么问题”~

本人现在做的一个小片段才261bp,做了一个多月了,仍然没有找到重组子,但是在这之后来做的一个603bp的片段就很顺利,一下子就找到了很多重组子,并且现在已经测序正确了,这个只花了两周的时间。操作方法、连的载体、感受态细胞都一样,唯一不同的是序列不一样,再就是前者的His标签融合在N端,后者融合在C端,是不是因为这个有影响啊?为什么呢?

希望大家积极讨论,为我指点迷津啊~!!!
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polepolar

银虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
可能的原因是261bp的片断太小,胶回收时容易丢失,最好是回收完后鉴定一下浓度。
北京普尔普乐生物技术有限公司(www.polepolar.com)
2楼2012-07-24 12:33:35
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xiongyaoling

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
目的片段你是用双酶切还是单酶切,检测酶切是否完全!
3楼2012-07-24 14:56:25
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lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
261bp不短了,20bp我都连过。是PCR产物,酶切片段?连T载体还是其它?
4楼2012-07-24 14:59:05
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xn712100

银虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
261确实不算短,调整一下连接体系试试
5楼2012-07-25 08:45:30
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sd3824289

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
261不算短了!胶回收后建议用琼脂糖凝胶鉴定一下!测浓度有时候不是很准确,但是凝胶比较准,但是缺点就是不能定量!只是个人建议!
坚持,就像流星,即使知道最后的结果,也要勇敢的走到最后!
6楼2012-07-25 10:28:55
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肖颖2009

铁虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by lihegang2000 at 2012-07-24 14:59:05
261bp不短了,20bp我都连过。是PCR产物,酶切片段?连T载体还是其它?

是PCR产物 ,再通过PCR处理把片段两端变成粘性末端然后连的酵母载体,跟pPIC9 K的载体差不多的那种。
7楼2012-07-26 17:11:54
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xiuyunji

铁虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你采用的是双酶切么?久攻不下的话,建议你尝试着采用两次单酶切,因为同一种酶单酶切体系下活力要高于双酶切体系
8楼2012-08-03 10:49:46
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