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zhuzhuba1

银虫 (初入文坛)

[求助] western blot 转膜后只看到marker条带,看不到样本,是怎么回事?

电泳在浓缩胶用80v跑了40分钟,蓝色的线到浓缩胶和分离胶交界处时转成120v,再跑1小时,蓝线到分离胶底部时结束。转膜用的是pvdf膜,用甲醇浸泡5秒,后放在转膜缓冲液中,转膜顺序正确,挤出气泡,转膜2个小时后,能看到marker条带清晰在膜上,但就是看不到蛋白,不知什么原因
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ytxy

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
yqbter: 金币+2, 鼓励发帖! 2012-07-21 15:56:22
zhuzhuba1: 金币+1, 有帮助 2012-07-23 14:55:53
marker 是预染的,有颜色的,当然能看见了。蛋白要最后通过发光物才能间接指示。你也可以把膜或胶用丽春红或考马斯亮蓝染一下,可以看出蛋白条带。
2楼2012-07-21 12:32:39
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zhuzhuba1

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by ytxy at 2012-07-21 12:32:39
marker 是预染的,有颜色的,当然能看见了。蛋白要最后通过发光物才能间接指示。你也可以把膜或胶用丽春红或考马斯亮蓝染一下,可以看出蛋白条带。

我用丽春红染了,还是看不到,会不会是电泳时间太久了
3楼2012-07-22 09:10:55
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废哥117

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
zhuzhuba1: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-07-23 14:56:08
甲醇一般激活30秒到一分钟,激活不充分的话,可能会转不上去,还有你的转膜条件是什么?是恒压还是恒流?
再一个就是你的上样量多少?蛋白浓度高或者低?丽春红的敏感度并不是很好,你可以在里面多染一会,或者你的丽春红已经失效
不断提高自己
4楼2012-07-22 11:26:22
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ankang0910

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
首先膜上有marker就说明转膜没有问题,2楼正解,marker 是预染的肯定能看见喽,关键是你染色的一步,现在常用化学发光,其他的没有接触过。
实验顺利!!
5楼2012-07-23 14:12:40
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