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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 3' RACE疑问
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含羞草liu

新虫 (小有名气)

[求助] 3' RACE疑问

我提取了RNA，用设计的兼并引物扩出了目的基因的部分序列，然后根据得到的序列设计特异性引物，进行3’ RACE，使用的是Takara的3’Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒。我共设计了两对引物，分别与试剂盒自带的Outer primer进行Outer PCR时，扩出的条带如图1所示。（其中RNA 1 和RNA 2 是我两次提取的RNA，引物1在扩出的部分序列5’端的50bp处，引物2在扩出部分序列5’端的143bp处）。
之前用兼并引物扩出出部分序列，是用的RNA1 反转录成的cDNA为模板的。 当用RNA1进行3’RACE时， 引物1条带很淡，而引物2进却有两条带，同样对于RNA 2，3’RACE的结果也不相同。我很疑惑，RACE可以出现两条带吗？如果是因为引物特异性不高而出现两条带，为什么不同的RNA的结果又不一样呢？这是引物的问题，还是提取的RNA质量的问题呢？还需要进行Inner PCR反应吗？
请各位帮个忙！不胜感激！！！

图1 3’ RACE电泳结果
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努力，奋斗，拼搏。。。
1楼 2012-07-20 10:16:39
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有你的目的条带吗？有的话，拿去直接测一下就知道了，如果没有，那就没用，可能要重新做
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含羞草liu
2楼2012-07-20 11:28:56
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含羞草liu

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-20 11:28:56
有你的目的条带吗？有的话，拿去直接测一下就知道了，如果没有，那就没用，可能要重新做

因为目的序列是未知的，不知道其准确长度，所以，不知道是否是目的条带……
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努力，奋斗，拼搏。。。
3楼2012-07-21 09:18:44
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 含羞草liu at 2012-07-21 09:18:44
因为目的序列是未知的，不知道其准确长度，所以，不知道是否是目的条带……...

你可以测一下看看到底是什么序列，你总有个实验目的吧，不知道目的序列有点不对吧
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4楼2012-07-21 17:39:43
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含羞草liu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-21 17:39:43
你可以测一下看看到底是什么序列，你总有个实验目的吧，不知道目的序列有点不对吧...

是这样的，目的序列是未知的，我是根据同源种的序列设计的兼并引物，扩出了一部分序列，再根据这段序列设计特异性引物，进行3’RACE，以扩出其全长。后面还要再进行5’RACE的。因为其准确的序列未知，所以用引物进行RACE扩增时也不知目的条带的长度……
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5楼2012-07-21 19:48:41
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xmchen1015

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
其实你的这个RACE做的已经是挺好的了，你所在意的出现两条带的情况，应该是非特异性带，跟模板，引物，反应条件都有关系。
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6楼2012-07-21 19:56:28
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含羞草liu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xmchen1015 at 2012-07-21 19:56:28
其实你的这个RACE做的已经是挺好的了，你所在意的出现两条带的情况，应该是非特异性带，跟模板，引物，反应条件都有关系。

我不知道这个RACE的结果是否可信，因为两次提的RNA用相同的引物，得出的结果不一样，也就是非特异性带的问题。除模板和引物不同外，RACE Outer PCR的条件是一样的。我真的很疑惑。现在已经将后面的三条带的PCR产物送去测序了，在等结果……
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努力，奋斗，拼搏。。。
7楼2012-07-21 20:51:38
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yananhl

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-20 11:28:56
有你的目的条带吗？有的话，拿去直接测一下就知道了，如果没有，那就没用，可能要重新做

我想问下，我做RACE5‘端，做出来的是单条带，但不是自己的基因，是引物的问题吗？我换了两次引物了，谢谢了！
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8楼2012-07-22 19:37:37
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nmhsd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不要纠结了，引物1和引物2，中间隔了多大，看看是不是两条亮带大小的差值，如果是，证明你RACE中引物1和引物2均成功，赶紧去测序吧。
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9楼2012-07-23 00:15:26
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含羞草liu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by nmhsd at 2012-07-23 00:15:26
不要纠结了，引物1和引物2，中间隔了多大，看看是不是两条亮带大小的差值，如果是，证明你RACE中引物1和引物2均成功，赶紧去测序吧。

我已经送去测序了，但测序的结果很不好。我是进行双向测序，5’端使用自己设计的引物都能测得序列，3’端使用Outer Primer，测序的结果均失败。而且5’端的序列前半部分的图谱很好，重叠很少，但后半部分重叠很严重。测序公司给我的反馈是，目的序列有较复杂的结构，很难测序。要怎样才能得到较好的RACE结果呢？我是直接用PCR产物送测的，但如果转化到大肠杆菌里再提取质粒，结果会好些吗？
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努力，奋斗，拼搏。。。
10楼2012-07-27 16:51:34
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