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含羞草liu

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[求助] 3' RACE疑问

我提取了RNA，用设计的兼并引物扩出了目的基因的部分序列，然后根据得到的序列设计特异性引物，进行3’ RACE，使用的是Takara的3’Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒。我共设计了两对引物，分别与试剂盒自带的Outer primer进行Outer PCR时，扩出的条带如图1所示。（其中RNA 1 和RNA 2 是我两次提取的RNA，引物1在扩出的部分序列5’端的50bp处，引物2在扩出部分序列5’端的143bp处）。
之前用兼并引物扩出出部分序列，是用的RNA1 反转录成的cDNA为模板的。当用RNA1进行3’RACE时，引物1条带很淡，而引物2进却有两条带，同样对于RNA 2，3’RACE的结果也不相同。我很疑惑，RACE可以出现两条带吗？如果是因为引物特异性不高而出现两条带，为什么不同的RNA的结果又不一样呢？这是引物的问题，还是提取的RNA质量的问题呢？还需要进行Inner PCR反应吗？
请各位帮个忙！不胜感激！！！

图1 3’ RACE电泳结果

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努力，奋斗，拼搏。。。

1楼 2012-07-20 10:16:39

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含羞草liu

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引用回帖:

9楼: Originally posted by nmhsd at 2012-07-23 00:15:26
不要纠结了，引物1和引物2，中间隔了多大，看看是不是两条亮带大小的差值，如果是，证明你RACE中引物1和引物2均成功，赶紧去测序吧。

我已经送去测序了，但测序的结果很不好。我是进行双向测序，5’端使用自己设计的引物都能测得序列，3’端使用Outer Primer，测序的结果均失败。而且5’端的序列前半部分的图谱很好，重叠很少，但后半部分重叠很严重。测序公司给我的反馈是，目的序列有较复杂的结构，很难测序。要怎样才能得到较好的RACE结果呢？我是直接用PCR产物送测的，但如果转化到大肠杆菌里再提取质粒，结果会好些吗？