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未央mercedes

新虫 (初入文坛)

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[交流] 烟草或胡萝卜的悬浮培养方法（来自云端实验室）

实验概要

把烟草或胡萝卜愈伤驯化成悬浮细胞。

主要试剂

1. 附加2%蔗糖，1%甘露醇，500mg/L水解乳蛋白，1.5ml/L 2，4-D的MS培养基，PH调到5.6~6.2。
2. 8%三氧化铬（CrO3）。

实验材料

松软的烟草或胡萝卜愈伤组织。

实验步骤

1. 用镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入三角瓶中并轻轻夹碎。每100ml三角瓶含灭过菌MS培养基10~15ml，每瓶接种1~1.5g愈伤组织，以保证最初培养物中有足够量的细胞。
2. 将已接种的三角置于旋转式摇床上。在100r/min，25~28℃条件下，进行振荡培养。
3. 经6~10天培养后，若细胞明显增殖，可向培养瓶中加新鲜培养基10ml，必要时，可用大口移液管将培养物分装成两瓶，继续培养。（若细胞无明显增殖，可能是起始材料不适当，应考虑用旺盛增殖期的愈伤组织重新接种）。可进行第一次继代培养。
4. 县浮培养物的过滤：按“3”法继代培养几代后，培养液中应主要由单细胞和小细胞团（不多于20个细胞）组成。若仍含有效大的细胞团，可用适当孔径的金属网筛过滤，再将过滤后的县浮细胞继续培养。
5. 细胞计算。取一定体积的细胞县液，加入2倍体积的8%的三氧化铬（CrO3），置700℃水浴处理15min。冷却后，用移液管重复吹打细胞悬液，以使细胞充分分散，混匀后，取一滴县液置入血细胞计数板上计数。
6. 制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图：
（1）鲜重法（fresh weigh method）
在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮细胞培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。
（2）干重法（dry weigh method ）
可在称量鲜重之后，将细胞进行曲烘干，再称量干重。以干重为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制细胞干重生长曲线。
上述两种方法均需每隔2天取样一次，共取7次，每个样品重复三次，整个实验进行期间不再往培养瓶中换入新鲜培养液。
7. 细胞活力的检查。对于初学者，往往需要检测活细胞的比率。可在培养的不同阶段，吸取一滴细胞县液，放在载玻片上，滴一滴0.1%的酚藏花红溶液（用培养基配制）染色，在显微镜下观察。几活细胞均不着色，而死细胞则很快被染成红色。也可用0.1%荧光双醋酸酯溶液染色，凡活细胞将在紫外光诱发下显示蓝绝色荧光，有经验的操作者，则可根据细胞形态，胞质环流判别细胞的死活。
8. 细胞再生能力的鉴定：为了解悬浮培养细胞是否仍具有再生能力，可将培养细胞转移到琼脂固化的培养基上，使基再形成愈伤组织，进而在分化培养基上，诱导植株的分化。

注意事项

1. 上述步骤均灭菌操作，培养基、用具、器皿等要高压灭菌后方可使用。
2. 如培养液混浊或呈现乳白色，表明已污染。
3. 每次继代培养时，应在倒置显微镜下观察培养物中各类细胞及其它残余物的情况以有意识地留下圆细胞，弃去长细胞。

更多详细内容见E V E R L A B 云端实验室

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