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nmhsd

木虫 (正式写手)


[交流] 表达一个酶的催化亚基,要求有活性

实验所需,要做一个酶的表达。要求表达的这个酶有生物活性,易分离提取,预算问题暂不予考虑。本实验室有Sf-9昆虫细胞系,其他表达载体等均需购买。现主要有以下问题。
1选用什么样的表达系统,大肠杆菌?酵母?昆虫杆状病毒?还是逐一去尝试?
2表达载体那些可以去找人要,有些必须从公司购买?
另外实验周期不要太长,没有太多时间了,尽量能在2个月之内完成。不知做过表达的前辈们能否指教小弟一二。
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dshlove

木虫 (正式写手)


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小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-07-16 13:43:23
nmhsd: 金币+3, 大肠杆菌确实太容易表达了,刚做了,只可惜都是包涵体,没活性 2012-10-01 00:17:50
个人觉得,表达系统可以先试试大肠杆菌的,如果能表达就最好了,毕竟其他两个系统相对麻烦。
载体,你可以拿自己实验室的先构建,需要的但是没有的就和别人交换,实在不行只能买商业化的了。
昆虫细胞,周期太长了啊。不顺利的话,还不知道什么时候出来,酵母我没做过,大肠杆菌的做的比较多,毕竟比较成熟,周期短。
2楼2012-07-16 09:11:05
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王礼鹏

金虫 (小有名气)


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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-16 13:43:36
nmhsd: 金币+5, 谢谢 2012-10-01 00:18:19
我认为要有活性用昆虫sf9细胞表达较好,因为真核表达系统有正确的折叠和修饰,对活性的维持有一定的作用。大肠杆菌好像容易形成包涵体,个人感觉比较麻烦。呵呵
3楼2012-07-16 09:29:22
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nmhsd

木虫 (正式写手)


引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-07-16 09:11:05
个人觉得,表达系统可以先试试大肠杆菌的,如果能表达就最好了,毕竟其他两个系统相对麻烦。
载体,你可以拿自己实验室的先构建,需要的但是没有的就和别人交换,实在不行只能买商业化的了。
昆虫细胞,周期太长了 ...

找同学要了一个pET-20a,及BL21大肠杆菌,正在构建载体,同时订购了Bac-to-Bac系统,估计一个月才能到货。
4楼2012-07-19 22:02:06
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nmhsd

木虫 (正式写手)


引用回帖:
3楼: Originally posted by 王礼鹏 at 2012-07-16 09:29:22
我认为要有活性用昆虫sf9细胞表达较好,因为真核表达系统有正确的折叠和修饰,对活性的维持有一定的作用。大肠杆菌好像容易形成包涵体,个人感觉比较麻烦。呵呵

时间不等人啊,直接订购了Bac-to-Bac表达系统。等试剂期间打算先用大肠杆菌表达一下
5楼2012-07-19 22:04:19
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dshlove

木虫 (正式写手)


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nmhsd: 金币+1 2012-10-10 18:12:24
引用回帖:
5楼: Originally posted by nmhsd at 2012-07-19 22:04:19
时间不等人啊,直接订购了Bac-to-Bac表达系统。等试剂期间打算先用大肠杆菌表达一下...

你大肠杆菌用低温诱导的么,改改条件,如果还是那样的话就只能用Bac-to-Bac表达系统了。
6楼2012-10-01 19:23:11
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