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nmhsd

木虫 (正式写手)

[交流] 表达一个酶的催化亚基，要求有活性

实验所需，要做一个酶的表达。要求表达的这个酶有生物活性，易分离提取，预算问题暂不予考虑。本实验室有Sf-9昆虫细胞系，其他表达载体等均需购买。现主要有以下问题。
1选用什么样的表达系统，大肠杆菌？酵母？昆虫杆状病毒？还是逐一去尝试？
2表达载体那些可以去找人要，有些必须从公司购买？
另外实验周期不要太长，没有太多时间了，尽量能在2个月之内完成。不知做过表达的前辈们能否指教小弟一二。
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1楼 2012-07-14 22:53:33
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dshlove

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
nmhsd: 金币+1 2012-10-10 18:12:24
引用回帖:
5楼: Originally posted by nmhsd at 2012-07-19 22:04:19
时间不等人啊，直接订购了Bac-to-Bac表达系统。等试剂期间打算先用大肠杆菌表达一下...

你大肠杆菌用低温诱导的么，改改条件，如果还是那样的话就只能用Bac-to-Bac表达系统了。
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6楼2012-10-01 19:23:11
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dshlove

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-07-16 13:43:23
nmhsd: 金币+3, 大肠杆菌确实太容易表达了，刚做了，只可惜都是包涵体，没活性 2012-10-01 00:17:50
个人觉得，表达系统可以先试试大肠杆菌的，如果能表达就最好了，毕竟其他两个系统相对麻烦。
载体，你可以拿自己实验室的先构建，需要的但是没有的就和别人交换，实在不行只能买商业化的了。
昆虫细胞，周期太长了啊。不顺利的话，还不知道什么时候出来，酵母我没做过，大肠杆菌的做的比较多，毕竟比较成熟，周期短。
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2楼2012-07-16 09:11:05
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王礼鹏

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-16 13:43:36
nmhsd: 金币+5, 谢谢 2012-10-01 00:18:19
我认为要有活性用昆虫sf9细胞表达较好，因为真核表达系统有正确的折叠和修饰，对活性的维持有一定的作用。大肠杆菌好像容易形成包涵体，个人感觉比较麻烦。呵呵
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3楼2012-07-16 09:29:22
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nmhsd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-07-16 09:11:05
个人觉得，表达系统可以先试试大肠杆菌的，如果能表达就最好了，毕竟其他两个系统相对麻烦。
载体，你可以拿自己实验室的先构建，需要的但是没有的就和别人交换，实在不行只能买商业化的了。
昆虫细胞，周期太长了 ...

找同学要了一个pET-20a，及BL21大肠杆菌，正在构建载体，同时订购了Bac-to-Bac系统，估计一个月才能到货。
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4楼2012-07-19 22:02:06
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