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bolomeer

铜虫 (小有名气)

[交流] 质粒提取 已有8人参与

我质粒的大小是5368bp,为什么质粒提取后电泳条大这么不在5368bp,而落在更大的条带?为什么两次酶切都出现降解?从电泳图谱看我的实验算不算成功,如果不成功的话,还有哪些需要改进的地方?

质粒条带



酶切条带
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-07-12 13:55:20
第一张图:点样孔比较亮,可以看出应该是有蛋白质污染,可以测测A260/A280,估计比值在1.8以下,手工提的吧?提的质量不太好,建议换试剂盒提,或者重新提一次.
第二张图:最右边泳道是mark吧,酶切体系是多少,质粒加了多少,量太少了,基本看不出酶切结果,建议加大质粒量酶切,电泳图太模糊了.
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
2楼2012-07-12 09:16:43
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applexixixi

木虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-12 13:55:32
第一张图靠近点样孔的是蛋白,手工提的质粒都难免,我每次提再怎么细心也有蛋白条带。
第二张酶切的图,是单酶切还是双酶切?看位置不像在5kb附近,而且条带太浅。
楼主的图为什么这么不清楚呢?是胶不干净吗,还是有气泡,视觉效果很不好,应该改进一下
3楼2012-07-12 09:34:47
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windsor2011

银虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
质粒纯度低,重提。另外调整酶切体系
只要功夫深铁杵磨成针
4楼2012-07-12 11:50:15
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bolomeer

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by windsor2011 at 2012-07-12 11:50:15
质粒纯度低,重提。另外调整酶切体系

谢谢
5楼2012-07-12 19:20:05
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jlc0225

至尊木虫 (著名写手)

Marker是多大的
开始新的学习!
6楼2012-07-12 19:45:32
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sadc

木虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
小丹木木: 金币+3, 呵呵,好全面的分析哇 2012-07-13 16:04:38
太多问题了:
1. 提的质粒,蛋白污染特别严重,上样孔那么亮,这可能都要直接干扰酶切了;
2. 质粒没有酶切前,跑出来的大小肯定和线性的Marker大小不一样的,通常有比较明显的3条带;
3. 酶切的质粒浓度太低了,5k多的质粒,这样淡,一是不好分析,二是往下做连接什么的都会很困难;
4. 把凝胶成像仪擦擦干净,电泳buffer换换,太脏了;
5. 电泳跑的时间太长了,明显已经分开了,还猛跑,全歪了;
还有,不想再找了~
7楼2012-07-12 21:43:37
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tupac225

金虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
新手吧,祝你好运。楼上的都说了,没啥说的了。
coasttocoast。
8楼2012-07-12 22:18:18
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sd3824289

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你这个图可以重新再跑一下,第一幅图,质粒浓度有点低,第二幅图,酶切条带也很弱,建议加大质粒的量或者增加酶切时间!
坚持,就像流星,即使知道最后的结果,也要勇敢的走到最后!
9楼2012-07-14 09:58:27
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bolomeer

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by sd3824289 at 2012-07-14 09:58:27
你这个图可以重新再跑一下,第一幅图,质粒浓度有点低,第二幅图,酶切条带也很弱,建议加大质粒的量或者增加酶切时间!

酶切时间增加是不是给容易降解
10楼2012-07-14 21:02:44
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