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czcpudai

铜虫 (正式写手)

[求助] RT-qPCR实验问题

大家好！我想问一下各位在做RT-qPCR的时候，用SYBR Green I荧光染色法，大家采用的定量的方法是什么？？？要是做标准曲线的话，各位的标准品是怎么制备的，是购买的呢，还是自己克隆的？？由于是第一次做，很多不是太明白？？？
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1楼 2012-07-04 10:31:57
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和一

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你要做什么啊？单纯的定量吗？标准品有商业化的，也可以使用已知浓度的质粒。
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2楼2012-07-04 11:08:03
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 和一 at 2012-07-04 11:08:03
你要做什么啊？单纯的定量吗？标准品有商业化的，也可以使用已知浓度的质粒。

我做的是SOD基因含量在用药前后的变化情况。那个质粒是不是要自己构建并且要含有自己的目的基因呢？？？
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3楼2012-07-04 12:26:16
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wqj1988926

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-04 13:54:23
一般是采用相对定量的方法的，如果用绝对定量的方法的话就必须先制备标准品，一般看这个基因常不常见，常见的话说不定会有商品化的质粒购买，否则就必须自己做克隆了
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风雪夜归人
4楼2012-07-04 12:32:49
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jimjohntall

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by czcpudai at 2012-07-04 12:26:16
我做的是SOD基因含量在用药前后的变化情况。那个质粒是不是要自己构建并且要含有自己的目的基因呢？？？...

做基因的表达，用相对定量就行了。
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5楼2012-07-04 12:36:30
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wqj1988926 at 2012-07-04 12:32:49
一般是采用相对定量的方法的，如果用绝对定量的方法的话就必须先制备标准品，一般看这个基因常不常见，常见的话说不定会有商品化的质粒购买，否则就必须自己做克隆了

恩  好的，谢谢！我想问的是要是用相对定量方法的话一般使用的是2-delta-delta-Ct吗？用这种方法的时候怎么保证其扩增的效率是1或者是如何计算器扩增效率？？？
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6楼2012-07-04 15:36:04
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jimjohntall at 2012-07-04 12:36:30
做基因的表达，用相对定量就行了。...

恩 谢谢！
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7楼2012-07-04 15:36:58
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wqj1988926

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-09 13:48:07
引用回帖:
6楼: Originally posted by czcpudai at 2012-07-04 15:36:04
恩  好的，谢谢！我想问的是要是用相对定量方法的话一般使用的是2-delta-delta-Ct吗？用这种方法的时候怎么保证其扩增的效率是1或者是如何计算器扩增效率？？？...

用自己的反转录的模版，梯度稀释，做一个类似的标准曲线，来确证扩增效率，因为这个扩增效率也只是在一定的浓度范围内是1，但其实大部分的情况下我们反转录的模版的浓度时符合的。
一般采用的方法是2-delta-delta-Ct
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风雪夜归人
8楼2012-07-04 16:00:13
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
恩，好的，非常感谢！！
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9楼2012-07-04 16:45:48
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l_h_10

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-05 13:44:07
看你的扩增效率，2-delta-delta-Ct方法有使用的限制，只有在一定条件内才可以使用这个方法。你详细查一下。
如果不觉得浪费试剂的话，最好用双标准曲线法。
另外可以把PCR产物切胶回收，回收的DNA稀释后做标准曲线。
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10楼2012-07-04 20:51:19
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