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1289622

木虫 (正式写手)

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[求助] 【求助】SRB法细胞检测操作步骤的一些问题

SRB检测的操作步骤：　
　1)细胞固定：药物作用时间终点时，每孔加入50μL4℃预冷的TCA溶液(30%，w/v)固定细胞，TCA溶液的终浓度为10%。静置5 min移入4℃冰箱中固定1 h，取出用去离子水冲洗5遍，室温晾干。
问题：
加TCA时为什么要逐滴加入，直接加入不行吗？
TCA固定细胞的原理是什么？
为什么要先在室温下 5min，然后再4摄氏度放置1小时？
有的说是晾干，有的说可以烘干，都可行吗？
为什么必须干燥，把水甩干净后直接进入染色步骤不行吗？室温晾干后可以长时间放置吗（比如过夜）？
4摄氏度放置1小时是什么作用？放半个小时会影响固定和测量结果吗？
为什么要先固定细胞在染色，直接染色不行吗（因为细胞是贴壁的，不固定也是长在底部的）？

　　2)染色：待96孔板室温下晾干后，每孔加入0.4%(w/v)的SRB染液(1%的乙酸配制)70μL，染色30 min后倒掉染液，用1%(v/v)乙酸冲洗4次，去除未结合的染料，室温晾干。

问题：
SRB对细胞染色的原理是什么？
染色是化学结合还是物理结合？
为什么不对死细胞染色？
室温晾干后能放多久（可以过夜放置吗）？
为什么必须干燥，把酸甩干净后直接加入tris碱不行吗？
这步的干燥也可以用烘箱烘干吗？

　　3)检测：用100μL非缓冲Tris-base碱液(10mM，pH=10.5)溶解与细胞蛋白结合的染料，水平摇床上振荡20min，采用酶标仪540nm处测定光吸收值。操作中，应注意洗除染料时操作需迅速，避免用移液器吸取液体，防止动作过慢造成与细胞蛋白结合的染料解吸附。

细胞计数板计数：
四个象限，每个象限16格（4×4），请问每个象限多少个细胞数范围计数准确？

因为之前算过，细胞浓度稀释4倍后得到的浓度（22万个/ml）与不稀释得到的浓度（113万个/ml)两者不是成四倍的关系，并且22×4与113差异比较大

操作步骤中的SRB有钠盐形式的也有酸式的，应该用那种？两者都一样？

此方法检测到的OD值达不到1.5-2.0的范围，大部分是在0.2-1.0这个范围，请问这个范围内测得的结果准确吗？（515nm检测波长）

[ Last edited by 1289622 on 2012-6-21 at 06:51 ]

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